您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
會(huì)員.png)
8
貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染操作步驟和注意事項(xiàng)
本文以RFect Plasmid DNA Transfection Reagent（RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒），作為攜帶質(zhì)粒穿膜的載體物質(zhì),，具體介紹DNA轉(zhuǎn)染方法。
圖. 用本產(chǎn)品4ul轉(zhuǎn)染1ug pEGFP-C2質(zhì)粒到293T細(xì)胞后，綠色熒光蛋白的表達(dá)情況,。
貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法步驟:
一、貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作流程（以24孔板轉(zhuǎn)染為例）
A. 細(xì)胞接種:
1. 轉(zhuǎn)染前24小時(shí)左右對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接,，接種密度約為每孔0.3~1×105個(gè)細(xì)胞,；
2. 過夜培養(yǎng)。
B. RFect /DNA復(fù)合物包裝（該步完成后應(yīng)立即轉(zhuǎn)染）：
1. 在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養(yǎng)基,，并添加適量的轉(zhuǎn)染試劑（2~5 μl/μg DNA,，參見下表）。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘,。
2. 在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養(yǎng)基,，并添加適量的DNA（0.8~1μgDNA/孔， 參見附表）,。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘,。
3. 將RFect-培養(yǎng)基混合物滴加至DNA-培養(yǎng)基混合物中，用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后,，立即轉(zhuǎn)染,。注意： RFect-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要，切勿顛倒,。
C.貼壁/懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染:
注意：RFect在*培養(yǎng)基中（基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清）具有很高的轉(zhuǎn)染效率,，因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無血清培養(yǎng)基。
1. 如特殊情況,，可在轉(zhuǎn)染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基,，以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細(xì)胞密度太大、營(yíng)養(yǎng)不足導(dǎo)致的細(xì)胞死亡,。
2. 將步驟B制備的復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中,。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿以使復(fù)合物均勻分布。
3. 過夜培養(yǎng)24~48小時(shí),。
4. 注意:如果轉(zhuǎn)染后需要更換新鮮培養(yǎng)基,，請(qǐng)于加入RFect/DNA復(fù)合物12~24小時(shí)后進(jìn)行。培養(yǎng)基更換后,，孵育24~48小時(shí)后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),。
5. 收獲細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),。
二,、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及注意事項(xiàng)：
1. 細(xì)胞接種：一般做轉(zhuǎn)染前一天接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)參見說明書,細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml）,，使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%；如果細(xì)胞是原代細(xì)胞,，接種密度可以密一些,，細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml；懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml）,，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%,。
2. 為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果，第1次使用建議您用24孔板做,，每孔1ug質(zhì)粒,，設(shè)置質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑2ul,3ul,4ul三個(gè)梯度，每個(gè)梯度做2-3個(gè)復(fù)孔（至少2個(gè)復(fù)孔,，避免實(shí)驗(yàn)誤差）,。DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例，通常推薦是1:2-1:3,。轉(zhuǎn)染條件（質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量,、比例）放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可。
3. 用來稀釋siRNA和稀釋轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基必須是無血清培養(yǎng)基,，因?yàn)檠宓拇嬖跁?huì)干擾DNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合,，并且影響轉(zhuǎn)染效率；
4. 檢測(cè)方法：轉(zhuǎn)染后48h收細(xì)胞做qPCR基因水平檢測(cè)或者轉(zhuǎn)染后72h收細(xì)胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測(cè),。
三,、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染一般疑難問題及解決方法
1、低轉(zhuǎn)染效率：
1）轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA的比例不合
根據(jù)建議選用配比濃度,，詳見下表,。
2）細(xì)胞狀態(tài)不佳，過密或過稀疏
細(xì)胞狀態(tài)不佳,，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良，細(xì)胞伸展不好,，細(xì)胞密度稀疏,，細(xì)胞過密都影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)左右對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接,，接種密度約為每孔0.3~1×105個(gè)細(xì)胞即可,。
3）抗生素?fù)p傷細(xì)胞
轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中含有抗生素會(huì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑相當(dāng)于細(xì)胞打孔,，這時(shí)培養(yǎng)基中存在抗生素則會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞,。
2．高細(xì)胞毒性：
1）質(zhì)粒DNA受內(nèi)毒素污染，或其他化學(xué)物質(zhì)的污染
未使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒,，對(duì)細(xì)胞損傷很大,。轉(zhuǎn)染過程中會(huì)造成細(xì)胞死亡,。
2）轉(zhuǎn)染后換液
使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)必須進(jìn)行換液,，否則會(huì)由于轉(zhuǎn)染試劑毒性而引細(xì)胞死亡,。本實(shí)驗(yàn)所采用的RFect試劑盒在*培養(yǎng)基中具有很高的轉(zhuǎn)染效率，操作簡(jiǎn)便,，可用于含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,，轉(zhuǎn)染前后不需要更換培養(yǎng)液。