貼壁/懸浮細胞瞬時轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染操作步驟和注意事項
本文以RFect Plasmid DNA Transfection Reagent(RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒),,作為攜帶質(zhì)粒穿膜的載體物質(zhì),,具體介紹DNA轉(zhuǎn)染方法。
圖. 用本產(chǎn)品4ul轉(zhuǎn)染1ug pEGFP-C2質(zhì)粒到293T細胞后,,綠色熒光蛋白的表達情況,。
貼壁/懸浮細胞瞬時轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染方法步驟:
一、貼壁/懸浮細胞瞬時轉(zhuǎn)染操作流程(以24孔板轉(zhuǎn)染為例)
A. 細胞接種:
1. 轉(zhuǎn)染前24小時左右對細胞進行轉(zhuǎn)接,,接種密度約為每孔0.3~1×105個細胞,;
2. 過夜培養(yǎng)。
B. RFect /DNA復(fù)合物包裝(該步完成后應(yīng)立即轉(zhuǎn)染):
1. 在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養(yǎng)基,,并添加適量的轉(zhuǎn)染試劑(2~5 μl/μg DNA,,參見下表)。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘,。
2. 在1.5 ml無菌離心管中加入50 μl無血清培養(yǎng)基,,并添加適量的DNA(0.8~1μgDNA/孔, 參見附表),。用移液器輕輕混勻后在室溫靜置5~10分鐘,。
3. 將RFect-培養(yǎng)基混合物滴加至DNA-培養(yǎng)基混合物中,用移液器輕輕混勻后在室溫靜置15~20分鐘后,,立即轉(zhuǎn)染,。注意: RFect-培養(yǎng)基混合物和DNA-培養(yǎng)基混合物的混合次序非常重要,切勿顛倒,。
C.貼壁/懸浮細胞瞬時轉(zhuǎn)染-RFect質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染:
注意:RFect在*培養(yǎng)基中(基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清)具有很高的轉(zhuǎn)染效率,,因此轉(zhuǎn)染前后不需要換成無血清培養(yǎng)基。
1. 如特殊情況,,可在轉(zhuǎn)染開始之前更換新鮮的含血清培養(yǎng)基,,以防轉(zhuǎn)染后孵育階段細胞密度太大、營養(yǎng)不足導致的細胞死亡,。
2. 將步驟B制備的復(fù)合物滴加至培養(yǎng)基中,。輕輕晃動培養(yǎng)皿以使復(fù)合物均勻分布。
3. 過夜培養(yǎng)24~48小時,。
4. 注意:如果轉(zhuǎn)染后需要更換新鮮培養(yǎng)基,,請于加入RFect/DNA復(fù)合物12~24小時后進行。培養(yǎng)基更換后,,孵育24~48小時后再進行后續(xù)實驗,。
5. 收獲細胞,,進行后續(xù)實驗。
二,、實驗準備及注意事項:
1. 細胞接種:一般做轉(zhuǎn)染前一天接種/鋪板(細胞計數(shù)參見說明書,細胞計數(shù)大約5*10^4cell/ml),,使做轉(zhuǎn)染前細胞密度在30-50%;如果細胞是原代細胞,,接種密度可以密一些,,細胞計數(shù)在2*10^6cell/ml;懸浮細胞可以在轉(zhuǎn)染當天接種/鋪板(細胞計數(shù)大約5*10^4cell/ml),,待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細胞密度30-40%,。
2. 為了能在使用時有較好的轉(zhuǎn)染效果,第1次使用建議您用24孔板做,,每孔1ug質(zhì)粒,,設(shè)置質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑2ul,3ul,4ul三個梯度,每個梯度做2-3個復(fù)孔(至少2個復(fù)孔,,避免實驗誤差),。DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例,通常推薦是1:2-1:3,。轉(zhuǎn)染條件(質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量,、比例)放大到對應(yīng)的孔板即可。
3. 用來稀釋siRNA和稀釋轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基必須是無血清培養(yǎng)基,,因為血清的存在會干擾DNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合,,并且影響轉(zhuǎn)染效率;
4. 檢測方法:轉(zhuǎn)染后48h收細胞做qPCR基因水平檢測或者轉(zhuǎn)染后72h收細胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測,。
三、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染一般疑難問題及解決方法
1,、低轉(zhuǎn)染效率:
1)轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA的比例不合
根據(jù)建議選用配比濃度,,詳見下表。
2)細胞狀態(tài)不佳,,過密或過稀疏
細胞狀態(tài)不佳,,細胞營養(yǎng)不良,細胞伸展不好,,細胞密度稀疏,,細胞過密都影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前24小時左右對細胞進行轉(zhuǎn)接,,接種密度約為每孔0.3~1×105個細胞即可,。
3)抗生素損傷細胞
轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中含有抗生素會影響細胞轉(zhuǎn)染效率。因為轉(zhuǎn)染試劑相當于細胞打孔,,這時培養(yǎng)基中存在抗生素則會進一步損傷細胞,。
2.高細胞毒性:
1)質(zhì)粒DNA受內(nèi)毒素污染,,或其他化學物質(zhì)的污染
未使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒,對細胞損傷很大,。轉(zhuǎn)染過程中會造成細胞死亡,。
2)轉(zhuǎn)染后換液
使用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染后4-6小時必須進行換液,,否則會由于轉(zhuǎn)染試劑毒性而引細胞死亡,。本實驗所采用的RFect試劑盒在*培養(yǎng)基中具有很高的轉(zhuǎn)染效率,操作簡便,,可用于含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)染,,轉(zhuǎn)染前后不需要更換培養(yǎng)液。