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操作規(guī)程

一,、復蘇

1、事先用Matrix進行培養(yǎng)皿/板的包被處理,。平時Matrix保存在-20℃,，使用之前放在4℃冰箱或冰上進行解凍。待Matrix解凍后,，按1：100的比例迅速用PBS液體稀釋,。按6孔板每孔加1ml,，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量加入,，加入后迅速搖動皿/板,，使加入的Matrix*覆蓋整個皿底。放到37℃培養(yǎng)箱中4小時,，使用前去掉包被液（如果暫時不使用,，用封口膜密封，在4℃冰箱能保存一周）,。

2,、復蘇前準備iCell解凍*培養(yǎng)基（iCell解凍液基礎培養(yǎng)基以及iCell解凍液添加劑）。加入適量的解凍液（6孔板每孔加2ml,，150px皿加3ml,，250px皿加9ml），另加入10ug/ml的Y27632因子,，放入37℃培養(yǎng)箱中。

3,、復蘇一支細胞用5ml的上述混合培養(yǎng)基,，復蘇之前要在37℃水浴鍋里充分預熱。從液氮罐里取出凍存管后,，迅速轉(zhuǎn)移到生物安全柜中（如果液氮罐的位置距離安全柜遠,，要用裝有液氮的容器把凍存管轉(zhuǎn)移到安全柜）,，并用加熱好的*培養(yǎng)基進行解凍（用移液槍不停的往凍存管中打入—抽出培養(yǎng)基,，交換溶解開的細胞，直至*溶解）,。

4、200Xg離心5分鐘,，去掉上清液,，加入1ml的iCell*解凍培養(yǎng)基（含10ug/ml的Y27632因子）,，用手指彈碎管內(nèi)沉淀,。按接種到每孔板/皿1ml的量，補充iCell*解凍培養(yǎng)基到離心管中,，輕輕吹吸三四次后加入培養(yǎng)皿/板中,。水平十字振動使細胞均勻分布,，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時,。

5、24小時后換成iCell*培養(yǎng)基（iCell基礎培養(yǎng)基以及iCell基礎培養(yǎng)基添加劑）。以后每隔22—24小時換液,。細胞長滿80-90%需要傳代或凍存,。

二,、傳代/凍存
1、傳代前要進行培養(yǎng)皿/板的包被處理，做法與復蘇時相同。培養(yǎng)基為iCell*培養(yǎng)基,，同時加入10ul/ml的Y27632因子,。

2,、傳代/凍存前,，準備37℃預熱好的無鈣鎂離子PBS溶液及傳代工作液（0.5mM EDTA+0.025%胰酶）。

3,、吸走iCell*培養(yǎng)基,，并加入37℃預熱好的PBS溶液清洗二次。

4,、加入適量（按6孔板每孔加1ml,，150px皿加2ml，250px皿加3ml的量）的37℃預熱好的傳代工作液,。

5,、37℃放置4-5分鐘（前一分鐘過后拿出來,，用手指輕彈幾下板/皿的底部），顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細胞間出現(xiàn)間隙但尚未相互分離,，肉眼觀察到細胞集落變得不透明且發(fā)白,，表明細胞消化時間理想,。

6,、迅速吸去傳代液,，加入適量的iCell*培養(yǎng)基終止消化,，用移液器扇形吹打皿/板底部（吹打不用超過10次）,，使附著的細胞集落脫落,。（如果消化時間不當，致使細胞*從皿/板底剝離的情況,，不用吸出傳代液,，加入同等量的iCell*培養(yǎng)基終止消化）。

7,、移入離心管,，離心后重懸,。傳代比例為1：8—1：12；凍存按6孔板每孔凍1支，150px皿凍2-4支,，250px皿凍6-12支,。每支加入0.8ml的90%iCell*培養(yǎng)基與10%的DMSO,。

8,、復蘇時按凍存前的1：4—1：6的比例進行,。

注意事項
1,、每次換液時要觀察細胞生長狀況以及細胞形態(tài)的變化并對細胞進行拍照,，但是在培養(yǎng)箱外操作的時間不要過長，避免因溫度對細胞生長狀態(tài)造成不利影響,。

2,、更換培養(yǎng)基之前，要對新的培養(yǎng)基進行37℃預熱,。為了避免反復加熱培養(yǎng)基而造成的培養(yǎng)基中各種成分的影響,，只對本次要更換的量進行預熱處理。

3,、用移液器吹打細胞,，因為移液管的端部較為圓滑，對細胞傷害的程度小于用1ml的槍,。

4,、細胞密度達到80-90%時要及時傳代,，否則會造成細胞形態(tài)的變化。但是,，如果細胞在鋪板時混合不均勻,，而形成部分集落過大的情況，即使沒有達到80-90%也要進行傳代,。