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大鼠原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)
一,、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞（酶消化法）
簡述：新生24h或E18胎鼠,，取腦，剝離海馬,，剪碎,，木瓜酶消化，清洗過篩后鋪于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中,。
二,、大鼠雪旺細(xì)胞（植塊法）
簡述：新生24h大鼠，取坐骨神經(jīng),，剝?nèi)ネ饽ず褪?，剪?mm3的小塊,，均勻鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，加少量血清,，37℃ CO2培養(yǎng)2h后,，再加入培養(yǎng)基，24-48h后有細(xì)胞爬出,。
三,、大鼠胰島（酶消化加密度梯度離心）
簡述：SD大鼠，常規(guī)麻醉,、固定,、消毒、進(jìn)腹,、膽總管插管,，逆行注入預(yù)冷的１mg/ml膠原酶P溶液10ml。迅速取下胰腺,，38℃水浴消化10分鐘,，600μm不銹鋼網(wǎng)過濾，加入4℃新生牛血清和4℃Hank’s液終止消化,。細(xì)胞懸液離心后,，4℃ Hank’s液洗滌兩次。沉淀物加25%Ficoll混勻,，其上依次分別加入23%,、20%、11%Ficoll溶液和Hank’s液,，離心后吸出23%-20% 及20%-11%界面的胰島,，用4℃Hank’s液洗滌離心共三次。
四,、大鼠心臟竇房結(jié)細(xì)胞（酶消化法）
簡述：大鼠心臟竇房結(jié)位于上腔靜脈靠近右心房處的內(nèi)壁上,；取出生2-3day的新生大鼠，75%酒精浸泡后,，固定于解剖板上,，開胸，顯微剪分離出上腔靜脈及右心房一部,，至于冷的HANKS緩沖液中,，于解剖鏡下觀察搏動(dòng)點(diǎn)，并剪去多余部分,；之后將幾只鼠的竇房結(jié)集中,，剪碎后用0.5mg/ml II型膠原酶37℃消化20-30分鐘，期間吹打數(shù)次,，可分部收集消化下來的細(xì)胞,。收集到的細(xì)胞加入10倍體積的PBS,，1000rpm離心5分鐘，棄上清,，重復(fù)清洗一遍,，沉淀中加入15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,，重懸細(xì)胞,，鋪板，37℃,，5%CO2 培養(yǎng)90分鐘后,，將未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng),，每天換液一次,。
五、大鼠關(guān)節(jié)滑膜間質(zhì)細(xì)胞（酶消化法）
簡述：大鼠麻醉后,，75%酒精消毒術(shù)區(qū),，于雙側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔取出滑膜組織，浸泡于含1%鏈霉素和青霉素的雙抗H-DMEM中,，低溫下轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái),。使用含1 %雙抗的PBS沖洗滑膜組織3次，用眼科剪將其剪成約1 mm×1 mm大小的組織塊,。加入10倍體積的0.4% Ⅰ型膠原酶,，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行4 h消化,，待絮狀物大部分消失后,，100μm細(xì)胞篩過濾，吸取濾過液,，1 200 r/min離心5 min,，棄上清液，無菌PBS洗滌3次,，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的H-DMEM高糖培養(yǎng)基(含200 mmol/L谷氨酰胺,，100 μmol/L抗壞血酸，100 U/mL青霉素,，100 mg/L鏈霉素),，以2×106/孔的細(xì)胞濃度接種于六孔板中，置37 ℃,，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
