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細胞培養(yǎng)相關(guān)知識
1.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好,？還是冷凍好？
要冷藏,！因為液體培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時，其溶液的PH值會發(fā)生改變,，溶液往往變堿,，某些成分溶解也會受到影響對細胞生長不利。故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中,，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個月 ~ 一年,。
2.液體培養(yǎng)基中谷氨酰胺的作用，及使用方法,。
幾乎所有的細胞對谷氨酰胺有較高的要求,，細胞需要谷氨酰胺合成蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時,，細胞生長不良而死亡,。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺,。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,，應(yīng)置-20 ?C冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中,。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4 ?C 冰箱儲存兩周以上時,，應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。
3.培養(yǎng)用液pH對細胞生長的影響
由于,，大多數(shù)細胞適宜pH為7.2~7.4,，偏離此范圍對細胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不*相同,，原代培養(yǎng)細胞一般對pH變動耐受差,，無限細胞系耐受力強。
但總體來說,，細胞耐酸性比耐堿性強一些,，偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。因此,，我們在配制培養(yǎng)用液時,，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些。液體在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時,，溶液的PH還會向上浮動0.2左右,。
4.常用培養(yǎng)基及培養(yǎng)用液的滲透壓范圍
培養(yǎng)基名稱 滲透壓范圍（mOSM）
DMEM（高糖） 315 ~ 350
DMEM（低糖） 270 ~ 330
RPMI-1640 260 ~ 290
MEM-EBSS 280 ~ 310
MEM-NEAA 280 ~ 310
McCoy 280 ~ 310
MEM-a 280 ~ 310
M—199 275 ~ 305
IMDM 270 ~ 300
DMEM/F-12 280 ~ 310
F—10 270 ~ 300
F—12 275 ~ 300
培養(yǎng)基名稱 滲透壓范圍（mOSM）
L—15 280 ~ 320
D-Hanks 280 ~ 300
Hanks 280 ~ 300
PBS 275 ~ 300
5.細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？
不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH,、溫度,、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下,，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力強,。另外，鈣,、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力,。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細胞培養(yǎng)瓶,，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈,，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
（1）０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ,；
（2）０.２５％胰蛋白酶＋０.０３％ＥＤＴＡ,。
（3）0.25% 胰蛋白酶
溶液ｐＨ８.０～９.０；使用Ｄ－Ｈａｎｋ液配制,。
多數(shù)細胞傳代消化可使用０.０５％胰蛋白酶＋０.０２％ＥＤＴＡ這種消化液,。
6.培養(yǎng)基在使用過程中應(yīng)注意的問題：
（1） 培養(yǎng)基在使用前需37 oC預(yù)熱或在室溫平衡后再使用。
（2） 細胞培養(yǎng)過程中,，吸取過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼,，防止殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)基焦化，將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中,。
（3） 盡量縮短各種液體,、細胞的暴露時間。
（4） 避免液體間,、細胞間的交叉污染,。
（5） 配制*培養(yǎng)基時，配制的量在2周內(nèi)用完為好,。
7.血清的有關(guān)問題：
新生牛血清：新出生牛5天內(nèi)取血制成
小牛血清：小牛出生16周以內(nèi)采血制成,。
胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎制成。
國內(nèi)廠家往往不能做到,，經(jīng)常把出生2天以內(nèi)采血稱為胎牛血清,。
根據(jù)血清的生產(chǎn)工藝及血紅蛋白、內(nèi)毒素含量又分為：
（1）.特級胎牛血清：40納米過濾,，內(nèi)毒素含量≤10EU,， 血紅蛋白含量≤10mg/dl。
（2）.優(yōu)等胎牛血清：經(jīng)過3次100納米過濾,，內(nèi)毒素含量≤25EU/ml,，血紅蛋白含量≤25mg/ml。
（3）.標準胎牛血清：3次100納米過濾，低內(nèi)毒素,， 低血紅蛋白含量,。
（4）.活性碳/葡聚糖處理血清：激素含量大大降低。
（5）.透析型胎牛血清：次黃嘌呤和胸腺核苷含量大大降低,。
8. 其他細胞培養(yǎng)用液：除培養(yǎng)基,、血清、谷氨酰胺外,，其他幾種液體也屬必須,，不可省略。
（1）雙抗：200倍,，（1ml/支）其終濃度為青霉素100U/ml；鏈霉素100ug/ml,，-24 oC保存,。
（2）L-谷氨酰胺：100倍，（1ml/支）,， 終濃度2mM,，-24 oC保存。
（3）丙酮酸鈉：配制濃度50mM,，4ml/支,，終濃度為1mM/ml， -24 oC保存,。
（4）Hepes液：配制濃度1M（5ml/支）,，一支Hepes加入到200ml
*培養(yǎng)基中，終濃度為25mM/ml,，常溫保存,。
9.支原體污染及檢測：
（1）支原體污染在細胞培養(yǎng)中常見、不易被查覺,，但支原體污染可顯著影響細胞功能干擾實驗結(jié)果,。支原體是介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的小微生物，它無細胞壁,，形態(tài)呈高度多形性,，小直徑0.2um，可通過濾器,。
目前通過對國內(nèi)100余株/系細胞的檢測,，形勢不容樂觀。污染率達30% ~ 60% ,。課題組從國外引進細胞株/系也經(jīng)常出現(xiàn)支原體的污染,。支原體在污染細胞后，它通過影響細胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養(yǎng)基中的氨基酸來抑制細胞的生長,，并能降低細胞的融合率,。因此，在運用各種細胞系進行實驗研究時,，首先要證明所用細胞有無支原體的污染,。
（2）支原體污染后，培養(yǎng)基可不發(fā)生渾濁,，細胞病變輕微或不明顯,，因此難以發(fā)現(xiàn)。目前,，支原體檢測的方法有以下幾種,。
（a）相差顯微鏡觀察；
（b）.低張?zhí)幚淼匾录t染色法,；
（c）熒光染色法,；
（d）酶標法；
（e）PCR法：使用該方法進行檢測,。
優(yōu)點：靈敏度高,，檢測耗時短，樣品量小
（只需50ul細胞培養(yǎng)用液上清）,。
缺點：引物及制劑費用較高,。