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影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的6大因素
轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù),。分為物理介導(dǎo)方法：電穿孔法,、顯微注射和基因槍；化學(xué)介導(dǎo)方法：如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法：有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,，和現(xiàn)在比較多見(jiàn)的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高,、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn),。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率快的方法,，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,，則各有其特點(diǎn),。需要指出的一點(diǎn)，無(wú)論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù),，要獲得很理想的轉(zhuǎn)染結(jié)果,，可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,，從細(xì)胞類型,、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)。
輝駿生物下面列舉一些細(xì)胞轉(zhuǎn)染6大影響因素:
1,、血清
A,、DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不能含血清，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成,。
B,、一般細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)可以耐受幾個(gè)小時(shí)沒(méi)問(wèn)題，轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加,，但血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。
C,、對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,，可以使用營(yíng)養(yǎng)豐富的無(wú)血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,，建議使用轉(zhuǎn)染試劑,。有條件的話，可以用無(wú)血清培養(yǎng)基代替PBS洗細(xì)胞兩遍,，注意洗的時(shí)候要輕,，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細(xì)胞,，而是轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面,。如果洗的太厲害，細(xì)胞又損失一部分,，加了脂質(zhì)體后,，細(xì)胞受影響就更大了，死亡細(xì)胞會(huì)增多,。
2,、抗生素(PS)
抗生素，比如青霉素和鏈霉素,，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物,。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞,。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,。所以,，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素,。這樣,，在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,，ICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外,，為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng),，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。
3,、細(xì)胞狀態(tài)
這點(diǎn)非常重要,，不要急于求成，一定要讓細(xì)胞處于生長(zhǎng)狀態(tài)再做,。有文獻(xiàn)說(shuō)傳代不要超過(guò)17代,。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀態(tài)是很不錯(cuò)的,，不要用傳了很多代的細(xì)胞去做，細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化,。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性,。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)不錯(cuò)的效果,。或者,，幾種來(lái)源于經(jīng)篩選,，轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售。
4,、細(xì)胞鋪板密度
用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異,。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少,，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí),，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿或處于靜止期,。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量,。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做,。
5.啟動(dòng)子的選擇
獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性,。同其他啟動(dòng)子,，如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性高,。這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系,，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子,，而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動(dòng)子,。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時(shí)會(huì)提高,，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。
6,、DNA量
高質(zhì)量的DNA對(duì)于進(jìn)行的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要,。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高,、無(wú)內(nèi)毒素,。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達(dá),，48小時(shí)mRNA表達(dá)高,；72h蛋白表達(dá)高。