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細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染情況及應(yīng)注意的小細(xì)節(jié)
污染是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問題,，某些污染的發(fā)生往往難以察覺及檢測,，而且污染源能長期共存于培養(yǎng)體系中。
常見污染情況有：
1.細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,，根據(jù)感染細(xì)菌的不同,，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃,，對細(xì)胞生長影響明顯,。
仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間足夠,，壓力是否足夠,，尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染,，使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象,。
可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理
2.霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì),，37度孵箱培養(yǎng)2-3天,，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì),，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物,，可看到明顯的菌絲,， 細(xì)胞仍可生長,，但時(shí)間長之后,，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，用硫酸銅溶液擦拭二氧化碳孵箱內(nèi),，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅,?；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
二氧化碳培養(yǎng)箱被霉菌污染后,，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移,，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）,。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí),，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后,，再移入細(xì)胞,。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右）,，尤其在多雨的季節(jié),。
3.支原體：黑色的，多為多形,，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會渾濁，原體感染,，而支原體是牛血清中常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去,。支原體感染細(xì)胞以后,，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢去除,?？梢允褂弥гw去除試劑或抗生素去除。
4.黑膠蟲：可以穿透濾膜,，也可以通過空氣傳播,，低倍下為黑色點(diǎn)狀,，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,，培養(yǎng)液也是不渾的,，一般不會太影響,，細(xì)胞還是可以用的,。 常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動物無明顯增多,，且培養(yǎng)液顏色,、透明度無明顯變化,，可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會 有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失,，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話,，可以增加細(xì)胞的種板密度,，以提高細(xì)胞的生存率,。
5.真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色,，鏡下有絲狀物,，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚,，象珊瑚狀,，不象細(xì)胞碎 片分不清，慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物,。真菌生長的比較慢,，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了,，也很難救活了,。
6.原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多,，輕微活動，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,，而且細(xì)胞狀態(tài)不好,，邊緣不清楚，細(xì)胞不 透亮,。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng),。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小,，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長,，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量 時(shí)就會影響到細(xì)胞的生長，終形成惡性循環(huán),。
注意的小細(xì)節(jié)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以75%乙醇擦拭無菌操作抬面,，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后,，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株,，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后,，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺,，以75 %乙醇擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后,，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作,。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品,，例如試管架,、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出,，以利于氣流之流通,。實(shí)驗(yàn)用品以75%乙醇擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域,，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作,。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品,，避免造成污染,。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn),。容器打開后,，以手夾住瓶蓋并握住瓶身,，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面,。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全,，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作,，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II),。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠產(chǎn)生,，小心毒性藥品,，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭的傷害等,。
5. 定期檢測下列項(xiàng)目： 二氧化碳鋼瓶內(nèi)二氧化碳壓力,； 二氧化碳培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度、溫度,、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水,，每周更換）；無菌操作臺內(nèi)之氣流壓力,，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA),。