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懸浮細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)
懸浮細(xì)胞的傳代
懸浮細(xì)胞傳代比貼壁細(xì)胞傳代稍微簡單一些,。由于細(xì)胞已經(jīng)在生長培養(yǎng)基中的懸浮,，因此無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離,，整個過程較為迅速，對細(xì)胞的損傷也較小,。懸浮培養(yǎng)時不進(jìn)行生長培養(yǎng)基的更換,；而是每2到3天加料一次，直到細(xì)胞匯合,?？梢灾苯釉谂囵B(yǎng)瓶中稀釋細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增,，或者也可以從培養(yǎng)瓶中取出一部分細(xì)胞,，將余下的細(xì)胞稀釋到該細(xì)胞系適宜的接種密度。懸浮細(xì)胞的傳代后的延滯期一般比貼壁細(xì)胞要短,。
懸浮細(xì)胞培養(yǎng)容器
懸浮培養(yǎng)可采用未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的無菌培養(yǎng)瓶（例如：不嗲折流板的搖瓶）進(jìn)行,；但是，專為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計的轉(zhuǎn)瓶（攪拌瓶）具有出色的氣體交換功能,，可進(jìn)行較大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)瓶有兩種基本設(shè)計,；其培養(yǎng)基由懸掛的攪拌棒或者垂直的葉輪攪拌（即攪動）,。垂直葉輪的換氣效果更佳。轉(zhuǎn)瓶總培養(yǎng)體積不能超過轉(zhuǎn)瓶標(biāo)示體積的一半,，以便換氣充分（例如：500ml轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)液體不能超過250ml）,。
所需材料
- 裝有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)容器
- 不帶折流板的搖瓶或者轉(zhuǎn)瓶
- *生長培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃
- 37℃培養(yǎng)箱,，充有二氧化碳濃度為5％的濕化空氣
- 磁力攪拌盤（如果使用轉(zhuǎn)瓶）,、滾架（如果使用滾瓶）或者搖床（如果使用傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿）
- 用于活細(xì)胞和總細(xì)胞計數(shù)的試劑和設(shè)備（例如：countess™||自動細(xì)胞計數(shù)儀、臺盼藍(lán)染料或血球計數(shù)器,。）
懸浮細(xì)胞傳代流程
所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài),。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行,。傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對數(shù)期,、未達(dá)到匯合狀態(tài)時進(jìn)行。達(dá)到匯合狀態(tài)時,，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會聚集成團(tuán)塊,，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶時培養(yǎng)基會變得渾濁。傳代前所建議的大細(xì)胞密度隨細(xì)胞系不同而有所差異,。
使用搖瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時
以下實驗方案介紹了利用振蕩培養(yǎng)箱和搖瓶進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時傳代的一般流程,。詳細(xì)的實驗方案，必須參閱針對具體的產(chǎn)品說明書,。
注：應(yīng)確保搖瓶中無折流板（即：位于培養(yǎng)瓶底部用于攪動的齒形板）,，因為折流板會破壞搖動節(jié)奏,。
- 當(dāng)細(xì)胞適合傳代（即：處于對數(shù)生長期未達(dá)到匯合狀態(tài)）時，從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶,，使用無菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細(xì)胞樣品,。如果吸取樣品前細(xì)胞已經(jīng)沉淀，應(yīng)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中均勻分布,。
- 通過此樣品，采用countess™||自動細(xì)胞計數(shù)儀或者血球計數(shù)器,、細(xì)胞計數(shù)儀按照臺盼藍(lán)拒染法測定總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞百分比,。
- 計算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度時需要加入的培養(yǎng)基體積
- 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時可將培養(yǎng)的細(xì)胞分到多個培養(yǎng)瓶中,。
- 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開一圈,，以便進(jìn)行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋），并將培養(yǎng)瓶放回振蕩培養(yǎng)箱,。搖晃速度取決于具體的細(xì)胞系,。
注：為了盡量減少細(xì)胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積，每三周（或者必要時）應(yīng)將細(xì)胞懸液輕輕離心一次,，離心力為100×g,，時間為5-10分鐘，然后用新鮮的生長培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀,。
使用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時
以下實驗方案介紹了利用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時傳代的一般流程,。詳細(xì)的實驗方案，必須參閱針對具體的產(chǎn)品說明書,。
請注意細(xì)胞對物理剪切作用很敏感,。應(yīng)確保葉輪可自由轉(zhuǎn)動，不會觸碰到容器壁或底部,。葉片頂部應(yīng)稍微高于培養(yǎng)基,。以確保培養(yǎng)系統(tǒng)換氣充分。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)動裝置,，使葉片不會觸碰容器和底部,。下表列出了不同尺寸轉(zhuǎn)瓶所需的小培養(yǎng)基體積。
我們建議開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時轉(zhuǎn)瓶容器不要超過500ml,。建議從方法成熟,、體積較小的轉(zhuǎn)瓶開始逐步擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模。
- 當(dāng)細(xì)胞適合傳代（即：處于對數(shù)生長期而未達(dá)到匯合狀態(tài)）時,，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶,，使用無菌吸管從培養(yǎng)瓶中取出少量細(xì)胞樣品。如果吸取樣品前細(xì)胞已經(jīng)沉淀,，應(yīng)轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中均勻分布,。
- 通過此樣品，采用countess™||自動細(xì)胞計數(shù)儀或者血球計數(shù)器,、細(xì)胞技術(shù)儀按照臺盼藍(lán)拒染法測定總細(xì)胞和活細(xì)胞百分比,。
- 計算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度時需要加入的培養(yǎng)基體積
- 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中。必要時可將培養(yǎng)的細(xì)胞分到多個培養(yǎng)瓶中
- 將培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋開一圈,，以便進(jìn)行充分的氣體交換,，并將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)速取決于所用細(xì)胞系和葉輪類型,。應(yīng)確保轉(zhuǎn)速始終在推薦值范圍內(nèi),，以免剪切應(yīng)力導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
注：為了盡量減少細(xì)胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在振蕩培養(yǎng)體系中蓄積,，每三周（或者必要時）應(yīng)將細(xì)胞懸液輕輕離心一次,，離心力為100×g，時間為5-10分鐘,，然后用新鮮的生長培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀,。
懸浮昆蟲細(xì)胞傳代的注意事項
雖然昆蟲細(xì)胞傳代的一般步驟與哺乳動物細(xì)胞相同，但是這些培養(yǎng)系統(tǒng)的一些關(guān)鍵要求有所不同,。為了獲得滿意結(jié)果,，實驗中必須嚴(yán)格遵守所用昆蟲細(xì)胞系附帶的操作說明。
- 進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時無需更換培養(yǎng)基,。定期傳代時需要吸出細(xì)胞懸液，然后加入適量培養(yǎng)基,，將細(xì)胞稀釋到適當(dāng)密度,。添加新鮮培養(yǎng)基后可使細(xì)胞營養(yǎng)素達(dá)到*補(bǔ)充。
- 培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時建議不要用二氧化碳交換,。
- 昆蟲細(xì)胞應(yīng)于27℃,、非濕化環(huán)境中培養(yǎng)?？蓪⒓?xì)胞放在操作臺上或者放入抽屜中于室溫下培養(yǎng),。但是，建議使用溫度控制在27℃的環(huán)境,。
- 使用昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基,。
- 使用表面活性劑降低剪切作用。進(jìn)行昆蟲細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時建議使用0.1％pluronic™,。F-68pluronic™ F-68（BASF)是一種表面活性,，可降低葉輪導(dǎo)致的細(xì)胞膜剪切作用 注：sf-900||SFM和expressFive™ SFM中已經(jīng)含有表面活性劑。
- 某些昆蟲細(xì)胞可能需要一定的過程來適應(yīng)懸浮培養(yǎng),。更多信息,，請參閱針對具體細(xì)胞的產(chǎn)品說明書或操作手冊,。
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