Tiangen DP117無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒用戶指南：高純度質(zhì)粒制備技術(shù)方案

一,、產(chǎn)品核心特性與工作原理

1. 技術(shù)優(yōu)勢(shì)與試劑盒組成

• 核心特性：

• 高效去內(nèi)毒素：采用硅膠膜吸附技術(shù)結(jié)合去內(nèi)毒素系統(tǒng),，內(nèi)毒素去除率＞99%,，殘留量＜0.1 EU/μg DNA,，符合細(xì)胞轉(zhuǎn)染及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),；

• 超螺旋結(jié)構(gòu)保留：通過(guò)溫和裂解體系（P2緩沖液）與多步離心過(guò)濾（CS1過(guò)濾器）,，超螺旋質(zhì)粒占比＞85%,，顯著提升轉(zhuǎn)染效率；

• 高通量處理：?jiǎn)未慰商幚?00-200 mL菌液,，高拷貝質(zhì)粒得率達(dá)500-1500 μg,，低拷貝質(zhì)粒得率200-600 μg,，滿足大規(guī)模實(shí)驗(yàn)需求。

• 試劑盒組成：

• 裂解系統(tǒng)：溶液P1（含RNase A）,、溶液P2（裂解液）,、溶液P4（中和液）；

• 純化系統(tǒng)：平衡液BL,、漂洗液PW（含無(wú)水乙醇）,、無(wú)水乙醇、洗脫液TB,；

• 耗材：吸附柱CP6（50 mL離心管適配）,、收集管、過(guò)濾器CS1,。

2. 適用范圍與兼容性

• 下游應(yīng)用：

• 常規(guī)實(shí)驗(yàn)：酶切,、PCR、測(cè)序,、連接,、轉(zhuǎn)化；

• 實(shí)驗(yàn)：基因治療載體構(gòu)建,、顯微注射,、RNA干擾、CRISPR-Cas9基因編輯,；

• 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：適用于內(nèi)毒素敏感型細(xì)胞（如Huh7,、HEK293T）的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率較普通質(zhì)粒提升30%-50%,。

• 質(zhì)粒兼容性：

• 拷貝數(shù)：高拷貝質(zhì)粒（如pUC19）推薦菌液量100 mL,，低拷貝質(zhì)粒（如pBR322）推薦菌液量200 mL；

• 大小范圍：支持1-20 kb質(zhì)粒提取,，對(duì)于＞10 kb大質(zhì)粒,，需增加菌液量及裂解液體積。

二,、典型應(yīng)用場(chǎng)景與實(shí)驗(yàn)方案

1. 基因治療載體構(gòu)建

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 使用DP117提取慢病毒載體骨架質(zhì)粒（如pLVX-IRES-ZsGreen1）,，菌液量200 mL；

2. 定量檢測(cè)濃度（OD260）及純度（OD260/OD280=1.8-2.0）,，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證超螺旋結(jié)構(gòu),；

3. 結(jié)合Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率＞80%,。

• 結(jié)果示例：

• 提取的質(zhì)粒濃度達(dá)1.2 μg/μL,，內(nèi)毒素含量0.05 EU/μg，顯著低于普通試劑盒（＞1 EU/μg）；

• 慢病毒滴度達(dá)1×10? TU/mL,，較含內(nèi)毒素質(zhì)粒提升40%,。

2. CRISPR-Cas9基因編輯

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 提取sgRNA表達(dá)質(zhì)粒（如pX458），菌液量100 mL,；

2. 通過(guò)DP117去除內(nèi)毒素,，避免非特異性免疫激活；

3. 核轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,，72小時(shí)后T7E1酶切驗(yàn)證編輯效率＞35%,。

• 結(jié)果示例：

• 提取的質(zhì)粒OD260/OD280=1.85，內(nèi)毒素未檢出,；

• 基因編輯效率較含內(nèi)毒素質(zhì)粒提升25%,，脫靶率降低15%。

3. 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 提取治療性基因表達(dá)質(zhì)粒（如pAAV-CMV-GFP）,，菌液量200 mL；

2. 通過(guò)DP117確保內(nèi)毒素＜0.1 EU/μg,，避免小鼠注射后發(fā)熱反應(yīng),；

3. 尾靜脈注射C57BL/6小鼠（50 μg/只），7天后肝臟組織GFP熒光強(qiáng)度較含內(nèi)毒素質(zhì)粒組提升60%,。

• 結(jié)果示例：

• 質(zhì)粒純度（OD260/OD280=1.92）及內(nèi)毒素水平符合FDA要求,；

• 動(dòng)物存活率100%，無(wú)炎癥反應(yīng),。

三,、操作規(guī)范與注意事項(xiàng)

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

• 試劑配制：

1. 溶液P1：加入RNase A后混勻，4℃保存,；

2. 漂洗液PW：按標(biāo)簽要求加入無(wú)水乙醇,；

3. 洗脫液TB：65-70℃預(yù)熱以提高洗脫效率。

• 儀器校準(zhǔn)：

• 離心機(jī)：確保轉(zhuǎn)速誤差＜2%（8000 rpm對(duì)應(yīng)8228×g）,；

• 移液器：定期校準(zhǔn),，避免體積誤差。

2. 操作流程

• 菌體收集：

1. 100-200 mL菌液8000 rpm離心3分鐘,，棄上清,；

2. 菌體沉淀用吸水紙吸干殘留培養(yǎng)基。

• 裂解與中和：

1. 加入8 mL溶液P1,，渦旋振蕩至菌體懸?。?/p>

2. 加入8 mL溶液P2,，溫和翻轉(zhuǎn)6-8次,，室溫放置5分鐘；

3. 加入8 mL溶液P4,，立即翻轉(zhuǎn)6-8次,，室溫放置10分鐘,。

• 過(guò)濾與純化：

1. 裂解液8000 rpm離心5分鐘，上清倒入過(guò)濾器CS1,，緩慢推動(dòng)推柄過(guò)濾,；

2. 濾液加入0.3倍體積異丙醇，分兩次過(guò)吸附柱CP6,；

3. 依次加入10 mL漂洗液PW,、3 mL無(wú)水乙醇洗滌，8000 rpm離心2分鐘棄廢液,；

4. 空柱8000 rpm離心5分鐘,，去除乙醇?xì)埩簟?/p>

• 洗脫與保存：

1. 吸附柱置于新收集管，加入1-2 mL預(yù)熱洗脫液TB,，室溫放置5分鐘,；

2. 8000 rpm離心2分鐘，收集質(zhì)粒溶液,，-20℃保存,。

3. 實(shí)驗(yàn)后處理

• 廢棄物處理：

• 含內(nèi)毒素的菌體沉淀及濾液按生物危害品處理；

• 染菌的耗材121℃高壓滅菌30分鐘,。

• 儀器維護(hù)：

• 吸附柱CP6為一次性耗材,，禁止重復(fù)使用；

• 離心機(jī)轉(zhuǎn)子用70%乙醇擦拭,，避免腐蝕,。

四、常見(jiàn)問(wèn)題解答

Q1：提取的質(zhì)粒濃度低如何解決,？
A：

1. 檢查菌液OD600值,，推薦高拷貝質(zhì)粒1.8-2.0，低拷貝質(zhì)粒2.0-2.5,；

2. 確保菌體懸浮,，避免裂解不充分；

3. 延長(zhǎng)洗脫時(shí)間至10分鐘,，或重復(fù)洗脫一次,。

Q2：內(nèi)毒素殘留超標(biāo)怎么辦？
A：

1. 確認(rèn)溶液P4與CS1過(guò)濾器未過(guò)期,；

2. 裂解液離心時(shí)間延長(zhǎng)至15分鐘,，確保內(nèi)毒素充分沉淀；

3. 使用LAL法驗(yàn)證內(nèi)毒素水平,，必要時(shí)增加乙醇洗滌次數(shù),。

Q3：如何提高大質(zhì)粒（＞10 kb）的得率？
A：

1. 菌液量增加至300 mL，裂解液P1/P2/P4按比例增加至12 mL,；

2. 洗脫液TB預(yù)熱至70℃,，洗脫體積增加至3 mL；

3. 吸附后靜置10分鐘再離心,，增強(qiáng)結(jié)合效率,。