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當(dāng)前位置：上海易匯生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>DP117--IRDye® 近紅外熒光染料用戶指南
高熒光強度：DP117--IRDye® 具熒光量子產(chǎn)率,，能夠在近紅外區(qū)域發(fā)射出明亮的熒光信號。這意味著即使在低濃度標(biāo)記的情況下,，也能產(chǎn)生足夠強度的熒光,，便于靈敏檢測，可有效檢測到低至皮摩爾級別的目標(biāo)分子,，極大地提高了檢測的靈敏度,，適用于微量生物樣品的分析。
良好的光穩(wěn)定性：該染料在長時間光照下,，熒光強度的衰減速度較慢,。相比一些傳統(tǒng)熒光染料,，DP117--IRDye® 能夠在多次激發(fā)和長時間成像過程中保持穩(wěn)定的熒光發(fā)射，減少了因光漂白導(dǎo)致的信號損失,，為需要長時間監(jiān)測或多次成像的實驗提供了可靠保障,，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
近紅外波長優(yōu)勢：發(fā)射波長處于近紅外區(qū)域,，在此波段生物組織的光散射和自發(fā)熒光顯著降低,。這使得在生物體內(nèi)或復(fù)雜生物樣品中的成像和檢測能夠獲得更高的信噪比，圖像更加清晰,，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確,。例如，在活體動物成像實驗中,，能夠?qū)崿F(xiàn)對深部組織中標(biāo)記物的清晰觀察,，有助于研究生物分子在體內(nèi)的分布和動態(tài)變化。
生物相容性好：經(jīng)過特殊的化學(xué)修飾,，DP117--IRDye® 在與生物分子結(jié)合后,，對生物分子的結(jié)構(gòu)和功能影響極小。在細(xì)胞實驗和活體動物實驗中,，不會顯著干擾生物分子的正常生理活動,，保證了實驗結(jié)果能夠真實反映生物分子的原本特性，為研究生物分子在生理和病理過程中的作用機制提供了有力工具,。
易于標(biāo)記：該染料設(shè)計有活性反應(yīng)基團,，能夠方便地與多種生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸,、抗體等）進行化學(xué)偶聯(lián),。標(biāo)記過程操作簡便，反應(yīng)條件溫和,，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的化學(xué)合成知識,，科研人員可在常規(guī)實驗室條件下完成標(biāo)記反應(yīng)，大大提高了實驗的可操作性和效率,。
生物分子準(zhǔn)備：確保待標(biāo)記的生物分子（如蛋白質(zhì),、核酸等）處于合適的緩沖液體系中，濃度已知且純度較高,。對于蛋白質(zhì),，建議純度達(dá)到 95% 以上，以減少雜質(zhì)對標(biāo)記反應(yīng)的影響,。如果生物分子濃度過低,，可通過濃縮方法提高濃度；若存在雜質(zhì)，可采用透析,、柱層析等方法進行純化,。
染料溶液配制：根據(jù)實驗需求，準(zhǔn)確稱取適量的 DP117--IRDye® 近紅外熒光染料粉末,。將其溶解于合適的有機溶劑（如二甲基亞砜,，DMSO）中，配制成高濃度的母液,。母液濃度一般建議為 10 - 100 mM,，具體濃度可根據(jù)實驗中所需的最終標(biāo)記濃度和標(biāo)記反應(yīng)體積進行調(diào)整,。溶解過程中,，可適當(dāng)振蕩或超聲輔助溶解，確保染料溶解,。溶解后的母液需避光保存,，防止染料因光照而降解。
反應(yīng)緩沖液選擇：根據(jù)待標(biāo)記生物分子的性質(zhì),，選擇合適的反應(yīng)緩沖液,。例如，對于蛋白質(zhì)標(biāo)記,，常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液（PBS,，pH 7.2 - 7.4）、Tris - HCl 緩沖液（pH 7.5 - 8.5）等,。緩沖液的 pH 值和離子強度對標(biāo)記反應(yīng)有重要影響,，需嚴(yán)格控制在合適范圍內(nèi)。一般來說,，反應(yīng)緩沖液的 pH 值應(yīng)接近生物分子的等電點,，以促進染料與生物分子的反應(yīng)。
確定標(biāo)記比例：根據(jù)實驗?zāi)康暮徒?jīng)驗,，確定染料與生物分子的摩爾比,。通常，對于蛋白質(zhì)標(biāo)記,，染料與蛋白質(zhì)的摩爾比可在 5 - 20:1 之間選擇,；對于核酸標(biāo)記，摩爾比可適當(dāng)調(diào)整,。較高的摩爾比可增加標(biāo)記程度,，但可能會影響生物分子的活性；較低的摩爾比則標(biāo)記程度可能不足,。在初次實驗時,，建議設(shè)置幾個不同的摩爾比梯度，以優(yōu)化標(biāo)記條件,。
混合反應(yīng)體系：按照確定的標(biāo)記比例,，將適量的生物分子溶液,、染料母液和反應(yīng)緩沖液依次加入到反應(yīng)容器中。反應(yīng)總體積根據(jù)實驗需求確定,，一般在幾十微升到幾毫升之間,。加入試劑時，需緩慢滴加并輕輕混勻,，避免產(chǎn)生氣泡,。例如，在標(biāo)記蛋白質(zhì)時,，先將蛋白質(zhì)溶液加入到反應(yīng)管中,，再逐滴加入染料母液，邊加邊輕輕渦旋混勻,，最后加入適量的反應(yīng)緩沖液定容至所需體積,。
反應(yīng)條件控制：將混合好的反應(yīng)體系置于適當(dāng)?shù)臏囟群头磻?yīng)時間下進行標(biāo)記反應(yīng)。一般情況下,，標(biāo)記反應(yīng)在室溫（20 - 25℃）下進行 1 - 2 小時即可獲得較好的標(biāo)記效果,。對于一些對溫度敏感的生物分子，可適當(dāng)降低反應(yīng)溫度,，但反應(yīng)時間可能需要延長,。反應(yīng)過程中，需將反應(yīng)容器避光放置,，可使用鋁箔包裹反應(yīng)管,，以防止染料受光照影響。同時,，可將反應(yīng)容器置于搖床上,，以低速（50 - 100 rpm）振蕩，促進反應(yīng)充分進行,。
透析法：標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后,，可采用透析法去除未反應(yīng)的染料。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中,，透析袋的截留分子量應(yīng)根據(jù)生物分子的大小選擇,，確保生物分子保留在袋內(nèi)，而小分子的未反應(yīng)染料可透過透析袋擴散到透析液中,。將透析袋置于大量的透析緩沖液（如 PBS）中,，4℃下透析過夜。期間需更換 2 - 3 次透析緩沖液,，以去除未反應(yīng)的染料,。透析結(jié)束后，取出透析袋內(nèi)的標(biāo)記產(chǎn)物，可進行后續(xù)的濃度測定和實驗應(yīng)用,。
柱層析法：另一種常用的純化方法是柱層析法,，如凝膠過濾層析。選擇合適的凝膠過濾柱（如 Sephadex G - 25 等）,，根據(jù)柱子的說明書進行平衡,。將標(biāo)記反應(yīng)液小心上樣到柱子中，然后用洗脫緩沖液（如 PBS）進行洗脫,。標(biāo)記的生物分子由于分子量較大,，會先于未反應(yīng)的染料從柱子中流出。收集含有標(biāo)記生物分子的洗脫液,，通過檢測洗脫液的熒光強度和蛋白質(zhì)濃度（或核酸濃度）,，確定標(biāo)記產(chǎn)物的收集范圍。收集后的標(biāo)記產(chǎn)物可進一步濃縮或直接用于實驗,。
熒光強度測定：使用熒光分光光度計或多功能酶標(biāo)儀等儀器測定標(biāo)記產(chǎn)物的熒光強度,。根據(jù)儀器的操作說明，設(shè)置合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長,。對于 DP117--IRDye®，激發(fā)波長一般在 700 - 750 nm 左右,，發(fā)射波長在 750 - 800 nm 左右,。將標(biāo)記產(chǎn)物稀釋至合適濃度后，加入到比色皿或酶標(biāo)板孔中,，進行熒光強度測量,。通過與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品熒光強度進行比較，可計算出標(biāo)記產(chǎn)物中染料的含量,，進而評估標(biāo)記程度,。
標(biāo)記產(chǎn)物活性檢測：對于標(biāo)記后的生物分子，需檢測其生物活性是否受到標(biāo)記過程的影響,。例如,，對于標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可采用其相應(yīng)的酶活性測定方法,、免疫結(jié)合實驗等檢測其活性,；對于標(biāo)記的核酸，可通過 PCR 擴增,、核酸雜交等實驗檢測其功能,。將標(biāo)記產(chǎn)物的活性與未標(biāo)記的生物分子進行對比，評估標(biāo)記過程對生物分子活性的影響程度,。若標(biāo)記產(chǎn)物活性明顯下降,，可能需要調(diào)整標(biāo)記條件或優(yōu)化純化步驟。
成像分析（若用于成像實驗）：在生物成像實驗中，根據(jù)實驗設(shè)計將標(biāo)記產(chǎn)物引入到細(xì)胞或活體動物體內(nèi),。使用近紅外熒光成像系統(tǒng)進行成像,，系統(tǒng)一般包括激發(fā)光源、濾光片組,、成像探測器等部分,。設(shè)置合適的激發(fā)光強度、曝光時間等參數(shù),，獲取熒光圖像,。通過分析圖像中熒光信號的分布和強度，研究生物分子在細(xì)胞或組織中的定位,、分布和動態(tài)變化等信息,。在圖像分析過程中，可使用專業(yè)的圖像分析軟件,，對熒光強度進行定量分析,，比較不同實驗組之間的差異。
染料保存：DP117--IRDye® 近紅外熒光染料對光敏感,，應(yīng)避光保存于 - 20℃冰箱中,。避免染料反復(fù)凍融，建議將染料分裝成小份,，每次使用時取出一份,，剩余的繼續(xù)保存，以保持染料的穩(wěn)定性和活性,。
操作安全：在使用染料和相關(guān)有機溶劑（如 DMSO）時,，需佩戴手套、護目鏡等防護裝備,。DMSO 具有較強的皮膚滲透性,，避免皮膚直接接觸。若不慎接觸到染料或有機溶劑,，應(yīng)立即用大量清水沖洗,，并及時就醫(yī)。
實驗條件優(yōu)化：不同的生物分子和實驗?zāi)康目赡苄枰煌臉?biāo)記條件,。在進行正式實驗前,，建議進行預(yù)實驗，優(yōu)化標(biāo)記比例,、反應(yīng)時間,、溫度等條件，以獲得最佳的標(biāo)記效果和生物分子活性,。
儀器兼容性：在進行熒光檢測和成像時,，確保所使用的儀器（如熒光分光光度計,、成像系統(tǒng)等）的波長范圍能夠覆蓋 DP117--IRDye® 的激發(fā)和發(fā)射波長。同時,，根據(jù)儀器的性能和靈敏度,，調(diào)整樣品的濃度和檢測參數(shù)，以獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果,。
生物樣品處理：在處理含有標(biāo)記生物分子的生物樣品時,，應(yīng)遵循相關(guān)的生物安全和實驗室廢棄物處理規(guī)定。對于廢棄的標(biāo)記樣品和實驗廢棄物,，需進行妥善處理,，避免對環(huán)境造成污染。
熒光強度低：可能原因一是標(biāo)記比例過低,，可適當(dāng)增加染料與生物分子的摩爾比,，重新進行標(biāo)記反應(yīng)；二是標(biāo)記反應(yīng)不充分,，可延長反應(yīng)時間或提高反應(yīng)溫度（但需注意生物分子的穩(wěn)定性）,；三是標(biāo)記產(chǎn)物純化過程中損失過多，可優(yōu)化純化方法,，如縮短透析時間或調(diào)整柱層析洗脫條件,。
生物分子活性降低：標(biāo)記比例過高可能導(dǎo)致生物分子活性受影響，應(yīng)降低染料與生物分子的摩爾比,；標(biāo)記反應(yīng)條件過于劇烈,，可調(diào)整反應(yīng)溫度和時間，采用更溫和的反應(yīng)條件,；標(biāo)記過程中引入的雜質(zhì)也可能影響生物分子活性，可進一步優(yōu)化純化步驟,，提高標(biāo)記產(chǎn)物的純度,。
成像背景干擾：未反應(yīng)的染料殘留可能導(dǎo)致成像背景過高，需加強標(biāo)記產(chǎn)物的純化,，確保去除未反應(yīng)的染料,；生物樣品自身的自發(fā)熒光也可能造成干擾，可通過選擇合適的濾光片,、優(yōu)化成像參數(shù)或使用自發(fā)熒光較低的生物樣品來降低背景干擾,。在成像過程中，還需注意儀器的校準(zhǔn)和環(huán)境光的屏蔽,，以提高成像質(zhì)量,。
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