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大鼠睡眠剝奪方法的研究進(jìn)展
雖然早已知道,，睡眠在人類及哺乳動物的生命活動中具有十分重要的生理意義，但迄今為止,，睡眠發(fā)生的確切機(jī)制卻尚未*闡明,。根據(jù)睡眠時的腦電圖、肌電圖及眼球運(yùn)動表現(xiàn),，可將睡眠分為非快速眼球運(yùn)動睡眠（ nonrapid eye movements,，NREM）和快速眼球運(yùn)動睡眠（ rapid eye movement，REM）或快波睡眠,。睡眠剝奪（ sleep deprivation）是研究睡眠的功能與發(fā)生機(jī)制的重要方法,，睡眠剝奪模型的選擇，將直接影響睡眠剝奪實驗的可靠性及準(zhǔn)確性,，對睡眠剝奪實驗結(jié)果具有重要的影響?，F(xiàn)將幾種常用的大鼠睡眠剝奪模型的方法、評價及進(jìn)展情況綜述如下,。
1 平臺睡眠剝奪技術(shù)（ platform technique）
此類方法又稱為花瓶技術(shù)（ flower pot technique）,，主要是利用大鼠畏水及在水中無法進(jìn)入睡眠的生活習(xí)性，通過在盛水的水槽中放置平臺,，讓大鼠站立在平臺上,，因平臺直徑足夠小（直徑6.5cm或更?。?，當(dāng)大鼠進(jìn)入REM時，因全身肌張力降低引起節(jié)律性低頭,、觸水,，以此來達(dá)到剝奪REM的目的。此類方法簡單易行,，無需復(fù)雜昂貴的設(shè)備,，在不同條件的實驗室均能開展，因而應(yīng)用廣泛,。其主要用來剝奪大鼠的REM,，可分為以下三種方法：
1.1 單平臺睡眠剝奪法（ single platform method,，SP）
此方法早于1964年由 Jouvet等應(yīng)用在貓的睡眠剝奪實驗中，不久以后,， Cohen將此方法應(yīng)用于大鼠的睡眠剝奪實驗,。方法為將一圓柱形小平臺（直徑約65mm），放置在長400mmx寬340mmx高160mm的水槽中,，往水槽中加水,，至平臺露出水面約10mm，將1只大鼠置于小平臺上,，大鼠可在平臺上站立,，可入NREM。當(dāng)大鼠進(jìn)入REM時,，全身骨骼肌張力明顯降低,，頸部肌張力降低引起節(jié)律性低頭、觸水,，從而無法進(jìn)人REM,。采用SP實驗可引起動物的體重及胸腺重量減輕、腎上腺重量增加,、血漿中腎上腺皮質(zhì)酮（CORT）增加,、動物攻擊行為增加、機(jī)體免疫反應(yīng)抑制等,。因SP是單只大鼠進(jìn)行實驗，且在實驗中大鼠的活動空間受限,，故有學(xué)者認(rèn)為以上的臨床與實驗室表現(xiàn)可能與大鼠的群體隔離或活動空間受限有關(guān),。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在實驗前群體飼養(yǎng)的動物,，當(dāng)與群體隔離后也會出現(xiàn)攻擊行為增加,、血漿中CORT增加、免疫功能抑制等表現(xiàn),，大鼠活動空間受限也可引起血漿中CORT的水平的增加,。這些結(jié)果與單平臺睡眠剝奪實驗中見到的類似。為克服SP中大鼠與群體分離及活動空間受限的缺點,，在SP基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展為多平臺睡眠剝奪法,。
1.2多平臺睡眠奪法（ multiple platform method，MP）
MP法由 Van Hulzen等于1981年早應(yīng)用在大鼠睡眠剝奪實驗中,。在MP中,，為擴(kuò)展大鼠的活動空間，將小平臺由SP中的1個增加至7個,，仍將1只大鼠放在小平臺間進(jìn)行睡眠剝奪試驗,。因大鼠可以在7個小平臺間自由活動,，故活動范圍較SP中有明顯增大。經(jīng)實驗比較,，在MP中,，反映應(yīng)激增強(qiáng)的一些指標(biāo)，如腎上腺重量增加和胸腺重量減少仍然存在,，甚至在大鼠血液中 ACTH,CORT的增加及腎上腺重量的增加較SP的更高,，提示MP較SP有更強(qiáng)的應(yīng)激性?？紤]到大鼠為群居動物,，單只大鼠實驗易導(dǎo)致與所在群體的隔離。為克服群體隔離所帶來的應(yīng)激反應(yīng),，有學(xué)者將MP法進(jìn)一步改良,，發(fā)展為改良多平臺睡眠剝奪法。
1.3 改良多平臺睡眠剝奪法（ modified multiple platform method, MMPM)
在MMPM中,，將10只大鼠（具體數(shù)目可根據(jù)實際需要確定）同時放在裝有14或15個小平臺的水槽中（長127cmx寬44cmx高45cm）進(jìn)行實驗,，這樣既避免了SP、MP中單只大鼠與群體隔離的缺點,，又保留了MP中活動范圍增大的特點,。因在實驗時大鼠多是3只或4只一籠進(jìn)行飼養(yǎng)，如1組實驗需10只大鼠,，則需要3籠或4絕大鼠,。考慮到來自不同籠中飼養(yǎng)2周,，實驗時再將這些大鼠放在一起同時進(jìn)行睡眠剝奪實驗,，這樣以克服實驗時大鼠群體不穩(wěn)定的缺點，從而將實驗時的不確定因素減至低,。實驗研究發(fā)現(xiàn),，在MMPM中，經(jīng)采取措施保持大鼠群體穩(wěn)定性及避免大鼠與群體分離后,，大鼠腎上腺重量,、體重減輕量、血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和腎上腺皮質(zhì)酮（CORT）的含量均較MP中為低,，提示MMPM較MP具有更低的應(yīng)激性,，是較為理想的REM剝奪方法。
2 強(qiáng)迫運(yùn)動睡眼剝奪法（ forced locomotion technique）
此類睡眠剝奪方法形式多樣,，在腦電監(jiān)護(hù)情況下可行全部的睡眠剝奪（ total sleep deprivation,，TSD）和選擇性的睡眠剝奪（ selective sleep deprivation，SSD）其共同特點是通過動力裝置,，迫使大鼠不停地運(yùn)動,，從而達(dá)到睡眠剝奪的目的,。此類方法的優(yōu)點是睡眠剝奪效果明顯，睡眠剝奪的時間及強(qiáng)度易于掌,、重復(fù)性好,，無須實驗人員隨時觀察實驗情況，減輕了實驗人員工作強(qiáng)度,。缺點是長時間運(yùn)動引起機(jī)體的一系列應(yīng)激反應(yīng),，可能干擾睡眠剝奪的實驗結(jié)果。現(xiàn)選取其中兩種有代表意義的方法介紹如下,。
2.1水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法（ large round horizontal platform method)
此方法應(yīng)用廣泛,，又稱為disk-over- water method、由 Rechtschaffen等于1983年早應(yīng)用在睡眠剝奪實驗中,。實驗裝置由一個電腦控制臺,、一個水平轉(zhuǎn)盤及兩個開放的長方形有機(jī)玻璃缸組成。轉(zhuǎn)盤直徑為46cm,，在電腦控制下可以按順時針,、逆時針方向隨機(jī)水平轉(zhuǎn)動。兩只有機(jī)玻璃缸的尺寸均為長60cmx寬20.5cmx高60cm,，在距離缸底5cm處的缸側(cè)壁開有一條縫隙,，使轉(zhuǎn)盤的一半能分別從縫隙伸入兩只玻璃缸中，并能隨意轉(zhuǎn)動,。缸底留置水約2cm深,，轉(zhuǎn)盤離水面約3cm。實驗前1周將睡眠剝奪大鼠頭頸部植入微電極,，并將微電極與電腦控制臺相連,。將大鼠放在轉(zhuǎn)盤上適應(yīng)環(huán)境1周，每天約1h,，讓大鼠習(xí)慣在轉(zhuǎn)盤上活動、進(jìn)水,、進(jìn)食等,。實驗時將實驗組的大鼠及對照組的大鼠分別置于兩只缸中的轉(zhuǎn)盤上，當(dāng)電腦通過微電極監(jiān)測到實驗組大鼠進(jìn)入慢波或快波睡眠的腦電信號后,，立即發(fā)出指令使轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動6s（6s內(nèi)轉(zhuǎn)動1/3圈）,，當(dāng)大鼠被轉(zhuǎn)到玻璃缸壁時，因被玻璃缸壁擋住而可能掉入水中,。每次在實驗組睡眠剝奪大鼠進(jìn)人睡眠時轉(zhuǎn)盤即轉(zhuǎn)動6s,，方向隨機(jī)，轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動時兩只大鼠均被動地隨著轉(zhuǎn)盤移動,。此方法一次只剝奪一只大鼠睡眠,，當(dāng)實驗組的睡眠剝奪大鼠在運(yùn)動,，進(jìn)食時，轉(zhuǎn)盤并不轉(zhuǎn)動,，而此時對照組的大鼠則可以趁機(jī)睡覺,，以彌補(bǔ)被剝奪的睡眠。此方法中睡眠剝奪組大鼠與對照組大鼠條件極其相似,，因而可減少因?qū)嶒灄l件不同而所致的應(yīng)激反應(yīng),，可進(jìn)行TSD和SSD實驗。
2.2 旋轉(zhuǎn)圓筒睡眠剝奪法（ rotating drum method）
此方法于1979年由 Alexander等早應(yīng)用于睡眠剝奪實驗中,。設(shè)備主要由一柱形圓筒及一小型慢速馬達(dá)構(gòu)成,。圓筒直徑30cm，高30cm,，圓筒底由PVC（聚氯乙烯）構(gòu)成,，側(cè)壁由直徑為10.4mm的PVC桿圍成，桿長度30cm,，桿之間間隔15.5mm,，圓筒與小型馬達(dá)相連，馬達(dá)轉(zhuǎn)速為每45s轉(zhuǎn)1圈（也有學(xué)者應(yīng)用每min轉(zhuǎn)1圈）,。至少在實驗前2d,，每天將大鼠放入圓筒中適應(yīng)環(huán)境1次，適應(yīng)時間不少于3h,。實驗時將馬達(dá)按45s1圈進(jìn)行勻速轉(zhuǎn)動,，通過圓筒的轉(zhuǎn)動帶動大鼠不停運(yùn)動而達(dá)到睡眠剝奪的目的。此類方法簡單易行,，睡眠剝奪效果明顯,，缺點是長時間不停運(yùn)動，可引起機(jī)體的運(yùn)動后應(yīng)激反應(yīng)及身體疲勞,，可能干擾睡眠剝奪實驗結(jié)果,。此類方法發(fā)展出多種變化Marcos等在進(jìn)行新生大鼠睡眠剝奪時將簡旋轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至2-3 r/min，后期逐漸增加至6-7 r/min,， Shen等將圓筒在30s內(nèi)旋轉(zhuǎn)180°,，每5min旋轉(zhuǎn)一次以達(dá)到睡眠剝奪的目的。
3 輕柔刺激法（ method of gentle handling）
此方法在短期的睡眠剝奪實驗中應(yīng)用較多,。當(dāng)實驗人員通過觀察大鼠行為或通過腦電波監(jiān)護(hù)觀察到大鼠進(jìn)入睡眠時,，通過輕輕拍打大鼠籠子，或應(yīng)用聲音,、光線的刺激促使大鼠保持清醒,，必要時還可用紙卷、鉛筆或用手直接觸摸大鼠，使大鼠無法進(jìn)入睡眠,。注意不能將大鼠移出籠外,。此方法簡單易行，在腦電監(jiān)護(hù)情況下可進(jìn)行TSD或SSD實驗,。在無腦電監(jiān)護(hù)時,，需要實驗人員在旁不間斷觀察大鼠行為，易導(dǎo)致實驗人員的睡眠剝奪,，故較適合較短時間的睡眠剝奪實驗,。
4 藥物睡眠剝奪法
定時給大鼠注射藥物（多為一些中樞興奮藥），也可剝奪部分或全部睡眠,，如注射咖fei因,、特殊的神經(jīng)毒素（DSP-4）、可樂定等,。此類方法簡單易行,，操作方便，不需要特殊儀器,。缺點是大鼠存在個體差異,，睡眠剝奪的效果及程度及不易掌握。多用在研究某些特殊藥物藥理作用的實驗中,。
文獻(xiàn)來自<<中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志 >>.