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比色計的工作原理分析
當單色光通過厚度相同,，而濃度很小的溶液時,，根據(jù)朗伯—比爾定律，光被溶液吸收的程度,，稱為吸收度,，與溶液的濃度成正比，與溶液的厚度成正比,，即A=εCL,，式中：A為吸收度，C為溶液的濃度,，L為溶液的厚度,，ε為消光系數(shù)。
由朗伯—比爾定律得,，當一束單色光通過一溶液時,，由于溶液吸收一部分光能，使光的強度減弱,。若溶液的濃度(或厚度)不變,，則溶液的厚度(濃度)愈大，光線強度的減弱也愈明顯,。
用同樣的方法配制的標準溶液和待測溶液,，其濃度分別為C1和C2，對同類溶液ε相同,，當厚度也相同時則：
A1=εC1L
A2=εC2L
C2=(A2/A1)*C1
式中A1,A2可由羅維朋比色計直接讀出,，C1為標準溶液的已知濃度，據(jù)此可算出待測溶液的濃度,。
朗伯—比爾定律
許多化學物質的溶液具有顏色(無色的化合物也可以加顯色劑經(jīng)反應生成有色物質),，當有色溶液的溶度改變時，顏色的深淺也隨之改變,，濃度愈大,，顏色愈深。因此,，可以用比較溶液顏色深淺的方法來測定有色溶液的濃度,。這種方法叫做比色分析法,。
一、 朗伯—比爾定律
當一束單色光通過有色溶液時,，入射光線的一部分被器皿反射回來,，一部分被溶液吸收，另一部分則透過溶液,，如圖所示,。它們之間有以下關系：
Io=Ia+Ir+It 1-1
式中：Io—入射光強度，Ia—吸收光強度,，Ir—反射光強度,，It—透過光強度
由于在實際測定時，所用的比色皿都是同質料用規(guī)格的,。反射光的強度為一定值,，不會引起測量誤差，所以反射光的影響可以不加考慮,。則上式可簡化為：
Io=Ia+It 1-2
從式1-2可知：當入射光強度Io為一定時,，被吸收光強度Ia愈大，則透過光強度It愈小,。也就是說：光強度的減弱僅與有色溶液對光線的吸收有關,。
那么，溶液對光線的吸收與哪些因素有關呢,？實驗證明：溶液的濃度C愈大,，液層厚度L愈厚(即光線在溶液中所經(jīng)過的路程愈長)，則溶液對光線吸收的愈多,。它們之間的關系有下式?jīng)Q定：
lg = KCL 1-3
這個公式就是朗伯—比爾(Lambert---Beer)定律,。
公式中的K稱為吸光系數(shù)，它表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時的吸光度,。在入射光的波長,、溶液種類和溫度一定的條件下，K為定值,。吸光系數(shù)是有色化合物的重要特性之一,，在比色分析中有著重要的意義。K值愈大,，表示該物質對光的吸收能力愈強,，濃度改變時引起吸光度的改變愈顯著，因此比色測定時靈敏度愈高,。
朗伯-比爾定律即有色溶液對一定強度光的吸收程度,，與液層厚度和溶液中有色物質濃度的乘積成正比。其中朗伯定律說明吸收光與厚度間的關系；比爾定律說明吸收光與濃度間的關系,。
朗伯—比爾定律在光電比色計中的應用
假定有兩種有色溶液，其中一種是已知濃度的標準溶液,，另一種是待測溶液,。根據(jù)公式：
在標準溶液中：As=KsCsLs 1-4
在待測溶液中：Ax=kxCxLx 1-5
將式1-4除以式1-5可得：
= 1-6
如果上述兩種溶液的液層厚度相等、溫度相同而且是同一種物質的兩種不同濃度的溶液,，測定時所選用的單色光的波長亦相同,，則有：
Ls=Lx、Ks=Kx ,，代入式1-6可得：
= 1-7
由此可見,，在上述條件下，吸光度與濃度成正比,。這一關系式就是光電比色計的設計依據(jù),，也是比色分析的基本計算公式之一。式中標準溶液的濃度Cs為已知,，As和Ax可用光電比色計測量出來,，則待測溶液的濃度Cx即可求出：
Cx = × Cs 1-8
由于在實際測定時，標準溶液和待測溶液都要加以稀釋,，而且在報告結果時,，多以100毫升(或1000毫升)中的含量來表示。因此,，在實際計算時,，就需要在上式中乘上稀釋因數(shù)。
求待測溶液濃度的方法有：直接比較法(計算法),、因數(shù)法和標準曲線法三種,。這些方法在“生物化學及生物化學檢驗技術”課程中有介紹。
波長的選擇：
由于有色溶液對光的吸收具有選擇性,，因此進行比色測定時,，濾光片必須加以選擇，否則靈敏度很低,，導致測量結果不準確,。選擇濾光的一般原則是：濾光片最大透過的光線應該是溶液最大吸收的光線。從顏色上看,，濾光片的顏色與待測溶液的顏色應為“互補色”,。
什么叫做互補色呢？凡是兩種顏色相加后能得到白色,，則此兩種顏色就稱為“互補色”,，圖中直接相對的兩種顏色，均為互補色。
為什么選擇濾光片時,，要使濾光片的顏色與待測溶液的顏色為互補色呢,？這是因為濾光片和有色溶液具有相似的透光特性，與它們本身顏色相同的色光,，能夠最大限度地透過,。而與它們本身顏色成互補的色光都能被最大地吸收。