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背景

水稻真菌病害多由真菌孢子引起,，真菌孢子是一種小型無性繁殖體,，主要通過空氣傳播。分生孢子越多,，傳播范圍越廣,，尤其是稻瘟菌（Magnaporthe grisea）和稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）。全球每年由稻瘟菌造成的水稻產(chǎn)量損失達(dá)數(shù)億公斤,。稻綠核菌一旦侵入籽粒,，就會(huì)直接導(dǎo)致水稻空粒率和癟粒率的增加。因此,，了解如何在水稻真菌孢子傳播的早期階段快速捕獲和準(zhǔn)確識(shí)別孢子,，對(duì)于早期病害預(yù)測至關(guān)重要,。

空氣成分復(fù)雜，微生物種類繁多,，孢子等微生物懸浮在氣流中,，處于不斷碰撞和聚集的狀態(tài)。因此,，從空氣中有效分離和捕獲孢子成為孢子檢測的首要問題,。與傳統(tǒng)的孢子捕獲方法相比，微流控技術(shù)是一種快速,、高通量的檢測方法,，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析、集成化,、小型化和低消耗,。目前已在生物醫(yī)學(xué)、食品檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域大放異彩,。

顯微高光譜成像技術(shù)結(jié)合了高光譜和顯微技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),。它可以在細(xì)胞水平上對(duì)微生物進(jìn)行無創(chuàng)檢測，具有快速,、無損的優(yōu)點(diǎn),。它不僅可以采集小目標(biāo)的圖像，還可以同時(shí)采集目標(biāo)區(qū)域的光譜信息,。目前已被用于開發(fā)真菌生長模擬模型,、花生黃曲霉素檢測等研究中。

因此,，本研究提出了一種基于微高光譜和微流控技術(shù)的水稻真菌孢子檢測方法,。針對(duì)稻瘟菌孢子和稻綠核菌孢子設(shè)計(jì)了微流控芯片，使芯片能夠分離空氣中的其他顆粒,，并在相應(yīng)富集區(qū)域采集這兩種類型的孢子,。結(jié)合顯微高光譜成像技術(shù)對(duì)孢子進(jìn)行檢測，并根據(jù)孢子的光譜特征建立分類模型,，為水稻真菌孢子的早期檢測提供了新方法和新思路,。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)

江蘇大學(xué)毛罕平教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了如圖1a所示的微流控芯片,。該芯片可分為三種結(jié)構(gòu),，每種結(jié)構(gòu)都有相應(yīng)的分離通道和富集區(qū)。一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為雙入口對(duì)稱預(yù)處理通道,，其中空氣中的孢子首先通過入口進(jìn)入一級(jí)結(jié)構(gòu),，然后通過鞘狀流道。鞘狀流道的主要功能是將含有孢子的氣流擠壓到微通道中,，保證進(jìn)入芯片的孢子在微通道中心形成單一的孢子流陣列,。在鞘狀流道之后增加一個(gè)減速通道,，以減少附加慣性力對(duì)孢子運(yùn)動(dòng)的影響。通道中的孢子在隨氣流移動(dòng)時(shí)也受到慣性的影響,。質(zhì)量和尺寸較小的孢子會(huì)隨著氣流移動(dòng),，進(jìn)入分離通道，到達(dá)結(jié)構(gòu)的下一層進(jìn)行分離,；而質(zhì)量和大小較大的孢子由于慣性會(huì)繼續(xù)向原來的方向移動(dòng),，最終會(huì)沖進(jìn)富集區(qū)。鞘流和分離通道的工作原理分別如圖1b,、c所示,。

圖1 微流控芯片的二維結(jié)構(gòu)（a）;鞘流工作原理示意圖（b）;分離通道工作原理示意圖（c）

后續(xù)對(duì)微流控芯片數(shù)值進(jìn)行模擬分析。利用COMSOL Multiphysics 6.0多物理場仿真軟件對(duì)微流控芯片的流場和孢子運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了數(shù)值模擬,，對(duì)芯片參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證和優(yōu)化,。為了獲得更好的模擬結(jié)果，模擬中使用5µm顆粒來表征稻綠核菌孢子,，12µm顆粒用來表征稻瘟菌孢子,，25µm顆粒用來表征空氣中較大的雜質(zhì)，2µm顆粒用來表征空氣中較小的雜質(zhì),。

本研究采用江蘇雙利合譜公司生產(chǎn)的GaiaMicro系列顯微高光譜成像系統(tǒng)用于孢子高光譜影像的獲取,。該系統(tǒng)主要由顯微鏡、V10光柵器件,、電荷耦合器件探測器,、數(shù)據(jù)采集模塊和計(jì)算機(jī)組成。有效波長范圍為400-1000 nm,，光譜分辨率為2.8 nm,，光譜采樣率為0.7 nm。通過計(jì)算每個(gè)感興趣區(qū)內(nèi)所有像素的光譜反射率的平均值作為該孢子樣本的光譜數(shù)據(jù),。兩種孢子共獲得300個(gè)光譜數(shù)據(jù),。為避免信息的冗余，文中采用競爭自適應(yīng)重加權(quán)抽樣（CARS）用于特征的優(yōu)選,，并使用支持向量機(jī)（SVM）和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）構(gòu)建最佳孢子分類模型,。

結(jié)論

為了找到隱藏參數(shù)的最佳值，并確保每個(gè)富集區(qū)域具有最高的富集效率,，采用不同范圍的值對(duì)隱藏參數(shù)進(jìn)行模擬,。發(fā)現(xiàn)當(dāng)通道角θ2為45度、寬度W1和W2均為1800 μm時(shí),，顆粒富集效率最高,。當(dāng)W4為1000 μm、W3/W4為1.2以及W6為500 μm,、W5/W6為1.6時(shí)分別對(duì)12 μm和5 μm的顆粒富集效率最高,。

圖2a-d為本研究設(shè)計(jì)的微流控芯片對(duì)不同粒徑顆粒富集效果的模擬,。粒徑大于或等于18 µm的顆粒由于慣性作用會(huì)沖進(jìn)富集區(qū)1a和1b，粒徑小于18 µm的顆粒會(huì)隨著氣流進(jìn)入二級(jí)結(jié)構(gòu),，粒徑在8 µm ~ 17 µm的顆粒會(huì)沖進(jìn)富集區(qū)2,。第三階段的分離和富集結(jié)構(gòu)與第二階段相似，粒徑在4 μm ~ 7 μm之間的顆粒進(jìn)入富集區(qū)3,，粒徑小于4 μm的顆粒直接從出口排出,。微流控芯片通道的速度分布圖如圖5e所示，微流控芯片通道的壓力分布強(qiáng)度圖如圖5f所示,。

圖2 富集區(qū)1a和1b為25 µm顆粒（a）;富集區(qū)2為12 µm顆粒（b）,；富集區(qū)3為5 µm顆粒（c）；從出口排出2 µm顆粒（d）,；微流控芯片通道速度分布（e）,；微流控芯片壓力分布（d）

圖3為孢子富集實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。將制備好的孢子懸浮液放置在氣溶膠發(fā)生器中,，空氣經(jīng)氣泵壓縮后送入氣溶膠發(fā)生器,，產(chǎn)生生物氣溶膠流。氣溶膠流進(jìn)入擴(kuò)散干燥器以除去水分,。烘干機(jī)后連接流量計(jì),，將流速設(shè)置為12.5 mL/min，與芯片模擬中的數(shù)值相同,。同時(shí),，每個(gè)鞘流口分別連接另一個(gè)微流量計(jì)，并設(shè)定鞘流口流量為2.5 mL/min,。最后的氣溶膠流進(jìn)入微流控芯片的通道以分離和富集孢子,。打開氣泵2 min后，孢子富集實(shí)驗(yàn)完成,。富集完成后,，用鑷子夾住PDMS膜，緩慢取出,。去除PDMS層的微流控芯片放置在顯微鏡下進(jìn)行直接觀察,。

圖3 孢子富集實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

圖4展示了富集區(qū)2和富集區(qū)3的微高光譜影像?？梢园l(fā)現(xiàn)仍有少量極小顆粒附著在稻瘟菌孢子上一起進(jìn)入富集區(qū),，但本實(shí)驗(yàn)平臺(tái)已具有良好的凈化效果。同時(shí)稻綠核菌孢子在富集區(qū)分布較為均勻,。最終,，本研究設(shè)計(jì)的微流控芯片對(duì)稻瘟菌孢子和稻綠核菌孢子的實(shí)際富集效率分別為82.67%和80.70%,。

圖4 稻瘟菌孢子富集結(jié)果（a）,；稻綠核菌孢子富集結(jié)果（b）

本研究使用CARS算法進(jìn)行特征優(yōu)選（圖5）,。隨著CARS算法迭代次數(shù)的增加，總體上保留的波段數(shù)量在不斷減少,，但減少的速度由快變慢,，這是由于CARS算法在特征波段篩選過程中從粗篩選到細(xì)篩選的變化。從RMSECV的變化趨勢可以看出,，隨著樣本數(shù)量的增加,，RMSECV有減小的趨勢。當(dāng)樣本數(shù)量為6個(gè)時(shí),，REMSECV最小,，所選擇的特征子集最優(yōu)。最終選取了34個(gè)特征波長,，占總波段的5.67%,。

圖5 CARS特征篩選結(jié)果

表1和表2分別展示了不同模型的分類結(jié)果以及分類指標(biāo)結(jié)果。以CARS篩選后的波段為變量的分類模型優(yōu)于以全波段為變量的分類模型,。通過比較CARS-SVM和CARS-CNN分類模型,，發(fā)現(xiàn)兩種模型對(duì)稻瘟菌孢子的分類結(jié)果相似。而CARS-CNN模型對(duì)于稻綠核菌孢子的分類結(jié)果中,，其二級(jí)指標(biāo)中的準(zhǔn)確率,、精確率、召回率和特異性分別為0.960,、0.950,、0.970和0.950，三級(jí)指標(biāo)的F1得分為0.960,，遠(yuǎn)高于CARS-SVM分類模型,。F1得分越接近1，說明分類效果越好,。因此,，CARS-CNN分類模型在稻綠核菌孢子分類中更有優(yōu)勢。

表1 不同模型的分類結(jié)果

表2 不同模型分類指標(biāo)結(jié)果

作者信息

毛罕平,，博士,，江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師,。

主要研究方向：現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)及環(huán)境自動(dòng)控制技術(shù),、智能化農(nóng)業(yè)裝備技術(shù)、生物信息探測與傳感技術(shù),、移栽機(jī)械,。

參考文獻(xiàn)：

Zhang, X.D., Song, H.J., Wang, Y.F., Hu, L., Wang, P., & Mao, H.P. (2023). Detection of Rice Fungal Spores Based on Micro- Hyperspectral and Microfluidic Techniques. Biosensors (Basel), 13.