固態(tài)光源點亮熒光原位雜交技術(shù)---提升生物醫(yī)學研究和臨床診斷新選擇

什么是FISH,？

當然這里的FISH并非水里游的魚類,，而是熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，簡稱FISH）,，這是一種基于雙鏈核酸互補堿基配對的細胞或者組織中特定核酸序列（DNA或者RNA）檢測的技術(shù),。就如同釣魚一般,，根據(jù)堿基互補原則，當使用已知標記單鏈核酸為探針（餌）,，如果與樣品中的未知單鏈核酸（魚）發(fā)生了特異性結(jié)合,，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，并對該特定核酸順序進行精確定量定位,。

F:熒光（Flourescence）顯微鏡用于對靶核酸序列位置進行成像,。該技術(shù)的其他變體也使用顯色原位雜交（CISH）。

IS:靶核酸序列在其所在的細胞或組織的空間環(huán)境中原位（in suit）檢測,。FISH提供有關(guān)位置的信息,，以及靶核酸序列的同一性和多樣性。

H:識別特定核酸序列的基本原理是通過互補堿基配對將單鏈探針序列與單鏈靶序列雜交（hybridization）（圖1）,。

圖1.熒光原位雜交(FISH)示意圖。用于臨床細胞遺傳學的DNA探針通常長度約為100,000個堿基(100 kb),，每100個堿基約有5個染料,。

FISH在生物醫(yī)學研究中的應(yīng)用

FISH使科學家和臨床醫(yī)生能夠繪制基因圖譜，研究染色體組織,，診斷和評估遺傳疾病,，并表征染色體異常。一個感興趣的領(lǐng)域是染色體末端端粒區(qū)域的分析,。端粒通過保護染色體末端不降解,，在細胞分裂過程中保存遺傳信息方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。端粒異常（如重復(fù)或缺失）可以通過使用FISH的篩選輕松識別,，其中端粒用熒光探針序列標記（圖2）（1）,。鑒于端粒不規(guī)則性可導致各種疾病，例如與年齡相關(guān)的綜合征或癌癥,，端?；兊蔫b定可以為疾病機制提供新的見解，并指導靶向治療的開發(fā)（2）,。

（1）Telomere analysis using 3D fluorescence microscopy suggests mammalian telomere clustering in hTERT-immortalized Hs68 fibroblasts.

（2）Molecular cytogenetic analysis of telomere rearrangements.

雖然FISH是生物醫(yī)學研究中使用的強大細胞遺傳學工具,，但細胞內(nèi)特定核酸序列的可視化在很大程度上依賴于照明的質(zhì)量和功能。通過在面對嚴苛的工作負載時能保持始終如一的性能,，Lumencor 光引擎使臨床醫(yī)生,、研究人員和設(shè)備制造商能夠?qū)崿F(xiàn)更好的基因組和分子診斷。

圖2.人類細胞的染色體組型,，該細胞在分裂中期含有46條染色體,。DNA以DAPI染色（藍）并通過使用PNA-TeIC探針(綠)以FISH檢測端粒。由于每條染色體含有兩個染色單體,，并且每個染色單體中都包含兩個端粒,，因此共觀察到184個雜交探針,。（圖像比例尺=5μm）

*圖像是使用Nikon Ti Eclipse寬場系統(tǒng)和Lumencor Light Engine獲取的，Lumencor系列固態(tài)光源可以適配各類主流顯微鏡品牌,。

FISH光源的五大照明要求,，固態(tài)光源來滿足

1.支持多重檢測的光譜范圍

Lumencor的SOLA FISH光引擎是為FISH應(yīng)用量身定做的型號，其輸出的光譜允許使用具有五個或者更多激發(fā)/發(fā)射波長范圍的熒光標記來同時檢測相應(yīng)數(shù)量的不同DNA靶序列,。遺傳性疾病通常是多因素的,，因此這種光譜的多樣性是一種普遍的要求。例如,，特異性分析物試劑盒（analyte specific reagent kits) 如Vysis MultiVysion PB 多色FISH探針試劑盒 (Abbott Molecular) 可以用于同時檢測13,、16、18,、21和22號染色體的拷貝數(shù),，這對于檢測對胎兒健康和生存能力有重大影響的染色體異常至關(guān)重要。固態(tài)光源（如SOLA FISH）有助于設(shè)計光譜輸出,，以盡可能滿足于此類細胞遺傳性測試的要求（圖3）,。

圖3.SOLA FISH光引擎輸出光譜和chroma激發(fā)濾光片，用于SpectrumBlue,、SpectrumAqua,、SpectrumGreen、SpectrumGold 和 SpectrumRed,。這些熒光團被摻入用于確定染色體 13,、16、18,、21 和 22 的拷貝數(shù)的 FISH 探針中,，這在多重檢測允許同時檢測。

2.線性光強調(diào)制

使用SOLA FISH等固態(tài)光源時,，輸出光可通過20倍動態(tài)范圍的線性控制響應(yīng)進行電子衰減,。當需要調(diào)整照明強度以適應(yīng)樣本之間的差異時，通過電子軟件控制即可完成,，這是可預(yù)測和可重復(fù)的方式,，而無需插入中性密度濾光片等附加光學元件。此外,，使用電子衰減時輸出光譜也不會受影響,。

3.設(shè)備間的一致性

當購買用于多個細胞遺傳學檢測設(shè)備的光源組時，所有光源的性能和操作特性的一致性至關(guān)重要,。低方差意味著內(nèi)部數(shù)據(jù)一致和操作效率,。固態(tài)光引擎（如 SOLA FISH）顯然滿足這些要求，多個設(shè)備間光譜輸出相當一致（圖 4）。

圖4.隨機選擇的28臺Lumencor SOLA光引擎的光譜分布和光功率,。2%的方差系數(shù)表明光引擎之間的一致性和相同的有效性能,。

4.使用壽命長、運行可靠

固態(tài)光源無需維護,，與每年需要數(shù)千美元更換燈泡的汞燈以及金屬鹵化物燈相比,，其耗材費用極低。SOLA FISH的成本可以在其10-15年的工作壽命內(nèi)的2-3年內(nèi),，通過耗材支出的節(jié)省得到回收,。

5.內(nèi)置計量和自動化兼容性

SOLA FISH 等現(xiàn)代固態(tài)光源集成了板載微處理器，除了控制操作外,，還可以監(jiān)控系統(tǒng)性能,。累計光輸出時長、功耗和內(nèi)部工作溫度等數(shù)據(jù)可用于上傳到實驗室信息管理系統(tǒng) （LIMS） 并支持監(jiān)管合規(guī)性驗證,。此外,，多個光引擎可以通過以太網(wǎng)連接，允許從單個中心點進行操作控制,。

總的來說,，Lumencor的SOLA FISH光引擎結(jié)合了厲害的技術(shù)、可靠性和成本效益,，使其成為各種研究和臨床環(huán)境中FISH應(yīng)用的選擇。

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