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從實驗室到生產線：固態(tài)光源技術在生物成像與工業(yè)檢測中的性能提升

生物醫(yī)學成像和工業(yè)計量的照明系統(tǒng)規(guī)格通常集中在光譜,、空間和時間的光輸出特性上,。Lumencor的技術支持總監(jiān)Iain Johnson和我們分享了固態(tài)光源陣列——LED、發(fā)光管和激光器組合成的固態(tài)光引擎如何實現規(guī)格定制,，以滿足特定應用的照明要求,。

固態(tài)光引擎是一個集中控制的固態(tài)光源陣列，其輸出合并到一個共同的光學傳輸系統(tǒng)中（圖1）,。光源的輸出可以并行激活以產生白光（圖2）,，或在需要分離的波長時，也可按順序進行激活（圖3,、圖4）,。光源本身可以采用一種固態(tài)照明技術，即LED,、光導管或半導體激光器,，也可以對這些光源技術進行組合。這可以根據zui終用戶的應用對亮度,、角度分布和輻照度的要求進行定制,。根據這一定義，光引擎輸出的光譜分布可以通過加法組合,，而這與傳統(tǒng)的寬光譜照明設備（電弧放電和白熾燈）形成鮮明對比,。傳統(tǒng)的照明設備產生的光譜分布在物理上是不變的，只能通過選擇性的阻擋和衰減來調整,。從工程學的角度來看,，固態(tài)光源的第二個主要優(yōu)點是，它的輸出可以在強度（圖2,、圖4）和時間（圖4,、圖5）方面進行精確控制。因此,，光譜輸出單元件的差異很?。▓D2），這使得光引擎應用于不同成像系統(tǒng)時，所獲得的數據質量能保持一致,。

圖1.固態(tài)光引擎及其輸出光譜的概念圖。四個固態(tài)光源的輸出被合并入一個共同的光路,，并通過光導耦合進入纖維及或者圖像掃描儀,。在實際操作中，光源可以是2-21個,，具體數量取決于應用要求,。光源可以是LED、光導管或半導體激光器其中的一種或組合,。它們的輸出可以經過濾波（F）以細化光譜,。輸出光的一部分會被分離出來，并導向參考光電二極管（rPD）,，以提供控制反饋,。

在大多數生物醫(yī)學成像應用中，不需要持續(xù)照明,，甚至在某些情況下,，會起到反效果，影響實驗數據,。通常情況下,，照明與相機曝光會同步進行。這里有兩個重點：首先是光源間的切換速度,，其次是脈沖間隔的復現性,。相比和機械濾光輪耦合的白光照明器（約50ms的切換時間），光引擎可以做到小于1ms的光源間切換（圖4）,，縮短了獲取多色圖像Z軸堆疊或者玻片掃描所需的時間,。脈沖間的積分不變形（圖5）是決定延時圖像序列保真度的關鍵因素。每個脈沖的積分量化了在延時序列中每次曝光所需的照度,。脈沖之間的照度差異越小,，樣品動態(tài)行為的敏感度就越能增加，這在圖像幀到幀的變化間可以體現,。

圖2.28臺SOLA V-nIR光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出曲線疊加,。光引擎的總光輸出由光譜曲線所包圍的區(qū)域來量化。所有28臺光引擎的平均輸出功率為4558mW,，標準差（n=28）為91mW,，相當于2%的方差系數（CV）。

圖3.SPECTRA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出,，包括LED,、發(fā)光管或激光器,。發(fā)光二極管和光導管的波長規(guī)格（nm）代表了中心波長（CWL）/半高全寬（FWHM），已經通過內置的濾光片來改進光源輸出,。功率（mW）是在光導（連接到顯微鏡或光學掃描儀）的遠端測量得到的,。

集成三種不同類型的固態(tài)光源，可以在整個可見光和近紅外波段內提供均勻的功率輸出,。

圖4.由TTL觸發(fā),，AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）交替輸出485nm（約0.5ms寬）和560nm（約3ms寬）的脈沖（示波器記錄）。圖中顯示了兩條疊加的示波器軌跡,，其中485nm的強度通過RS232串行命令從100%調整到55%,，而560nm的強度保持不變。485nm和560nm的脈沖時間間隔為0.25ms,。

圖5.模擬光電二極管（APD）檢測來自一臺5光源的AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）發(fā)出的5ms光脈沖,。圖中展示了10個脈沖序列，代表了每次數據采集中記錄的150個連續(xù)脈沖,。計算了150個脈沖序列中每個脈沖的積分光輸出。對于555/28 nm輸出,，150個脈沖的方差系數（CV）在555/28 nm脈沖串中為0.23%,，在635/22 nm脈沖序列中為0.20%。其他三個源通道的CV值相似（0.15-0.25%）,。

除了光譜帶寬（圖3）以外,，固態(tài)LED、光導管和激光器之間的主要區(qū)別在于其光輸出的角度分布,；LED和激光器之前的zui大區(qū)別如表1所示,。對于寬場顯微鏡應用，LED光源配置為科勒照明產生的均勻照明,，輻照度范圍為1-100mW/mm2,。然而，單分子定位顯微鏡（SMLM）需要更高的輻照度,，通過鏈接到顯微鏡臨界落射照明器（critical epilluminator）的CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）,，可以在樣品表明提供10^4mW/mm2的輻照度（圖6）。臨界照明的使用是由科勒照明在光學上的低效率所決定的,，因為科勒照明并沒有覆蓋整個光源表面或者發(fā)射光的全部角度分布,。在臨界照明中，光源被直接成像到樣品平面上,，這種方法更為高效,，但對光源輸出中的任何空間不均勻性也更為敏感。臨界落射照明器的作用是均勻化任何空間上的不均勻性,，以產生與典型scmos相機傳感器尺寸（~200mm2）相匹配的高輻照度照明場,。

表1. 光源比較

①輸出功率是在zhi定光導的遠端測量的

②使用光導將光源輸出耦合到顯微鏡或光學掃描儀

③光導的數值孔徑

④光通量積決定了光學檢測系統(tǒng)有效利用光源輸出的能力,。當光源的光通量積與光學系統(tǒng)的光通量積緊密匹配時，可以獲得很好的性能,。sr=球面弧度,。

針對光驅動生物技術以及工業(yè)應用，優(yōu)化光源的選擇性需要全面考慮儀器的光譜,、空間和時間要求,，這些正是需要照明光源來支持的。通常一種技術盡可以滿足其中的部分要求,，所以策略即是混合多種技術來滿足全部需求,。復雜的光引擎可以提供這樣一種集成的方法來混合光源，并克服任何給定技術的基本限制,，例如,，在熒光分析中，LED在500-600nm的光中由于臭名昭著的“綠色間隙"功率和亮度往往無法滿足,；或者相對于毫秒級的切換時間,，任何弧光燈的開/關不穩(wěn)定性；又或者廣譜光源進行多路復用研究時,，譜寬也帶來了限制,。如今各種固態(tài)光源各有優(yōu)劣，只有仔細評估它們的優(yōu)點與局限性,，才能為光驅動生命和材料科學應用的廣泛領域找到zui合適的照面解決方案,。

圖6.使用CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），通過一根直徑800um的光纖耦合到安裝在尼康Ti/Ti2顯微鏡的臨界落射照明器上,，并產生均勻的熒光玻璃成像,。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物鏡和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) scmos相機進行圖像捕捉。圖表顯示了相機沿著標記為紅色的對角線所記錄的灰度值,。右上角的插圖展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物鏡成像的同一樣品,。

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