雙光子顯微成像用飛秒激光器
雙光子激發(fā)熒光（TPEF）顯微鏡,，也稱(chēng)為雙光子顯微鏡，是對(duì)活體組織深層三維成像的方法,。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(yōu)勢(shì),，它使用了更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)（通常是近紅外波段），因而其帶來(lái)的散射比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見(jiàn)波長(zhǎng)更少,。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)同時(shí)也減少了來(lái)自散射光的背景照明,，并增加了在更高深度處的對(duì)比度。目前,，用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內(nèi)大腦圖像,。
在熒光顯微鏡中，當(dāng)兩個(gè)獨(dú)立的光子被一種介質(zhì)同時(shí)吸收時(shí),，就會(huì)發(fā)生雙光子激發(fā),。這需要兩個(gè)合適能量的光子在這樣的介質(zhì)上時(shí)間和空間上同時(shí)重合,；通常來(lái)說(shuō)這不需要非常大的激發(fā)光子通量，當(dāng)然光子通量越大,， 雙光子同時(shí)被吸收的概率就越大,。在TPEF顯微鏡中，更高的光子通量會(huì)帶來(lái)更高的效率,，從而帶來(lái)圖像質(zhì)量和分辨率的提升,。
在TPEF顯微鏡中，雙光子激發(fā)所需的大光子通量更多的是通過(guò)寬波段可調(diào)諧的鈦寶石飛秒激光器實(shí)現(xiàn)的,，激光器典型規(guī)格脈寬為100fs,，重復(fù)頻率約為80MHz，這可以給雙光子顯微鏡帶來(lái)非常高的峰值功率和大光子通量,。然而,，激光器較高的平均功率（在1~4瓦范圍內(nèi)）會(huì)由于激發(fā)波長(zhǎng)的線性吸收引起的與介質(zhì)的光熱相互作用而造成熱損傷。這種效應(yīng)在體內(nèi)成像中尤其重要,，因?yàn)闇囟瘸^(guò)40oC會(huì)導(dǎo)致不可逆的損傷,。因此，傳統(tǒng)的固態(tài)激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實(shí)際應(yīng)用于TPEF顯微鏡,，峰值功率也會(huì)相應(yīng)地降低,。保持較低的平均功率以避免熱損傷，同時(shí)縮短脈沖持續(xù)時(shí)間是一種替代的提高峰值功率的方法,。這減少了光子落在介質(zhì)上的時(shí)間間隔,，同時(shí)提高了介質(zhì)被吸收的概率。
近日,，西班牙FYLA公司利用先進(jìn)超連續(xù)譜全光纖激光器技術(shù)得到脈沖寬度短至15fs的商業(yè)激光器,，命名型號(hào)“SCH"。與傳統(tǒng)的100fs激光器相比,，SCH的15fs脈沖寬度可在相同平均功率水平下提供超過(guò)傳統(tǒng)飛秒激光器7倍的光子通量,。
圖1：FCH 寬光譜光纖飛秒激光器，波長(zhǎng)范圍950-115nm,，脈沖寬度15fs, 峰值功率>200kW
圖2：藍(lán)色線：SCH 飛秒激光器光譜曲線,；橙色線：1um波段百秒激光器光譜曲線；灰色線：紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜
但是,，巨幅提高每個(gè)時(shí)間和面積上可用光子數(shù)量對(duì)圖像的真正影響是什么呢,？
一、更高的激發(fā)效率,，更高的圖像亮度
理論上,，在雙光子顯微鏡中，圖像的亮度與激發(fā)效率直接相關(guān),，而激發(fā)效率*依賴(lài)于光子通量和熒光團(tuán)的二階非線性激發(fā)截面(GM) ,。作為一個(gè)例子,，我們可以嘗試計(jì)算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬（如SCH飛秒激光器）和1050nm中波長(zhǎng)照射下的激發(fā)效率。與100fs的激光器相比,，15fs激光器具有更寬的帶寬（達(dá)200nm）,，可以在900到1200nm之間激發(fā)mRFP，與100fs激光器的11nm相比,，這是一個(gè)更寬的光譜區(qū)域,。
圖3：藍(lán)色曲線：以1050nm為中心的SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率； 橙色曲線：以1050nm為中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率,；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵(lì)截面(GM)
考慮到各波長(zhǎng)的峰值功率和激發(fā)截面,，可以計(jì)算出mRFP的激發(fā)效率。結(jié)果表明,，與傳統(tǒng)100fs激光器相比較,，SCH飛秒激光器15fs的脈沖寬度使得激發(fā)效率提高了50%,。
圖4：藍(lán)色曲線：SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率,； 橙色曲線：100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵(lì)截面(GM)
圖5：小鼠腸道切片的2P熒光顯微鏡圖像,，用SYTOX Green標(biāo)記細(xì)胞核（黃色）和Alexa Fluor 568煥鈦標(biāo)記肌動(dòng)蛋白絲（藍(lán)色）
二,、多色同時(shí)激發(fā)
想象一下，同時(shí)成像多個(gè)波段范圍的熒光團(tuán),，而不必考慮選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)的激光器,。在雙光子顯微鏡中，使用傳統(tǒng)的100fs激發(fā)激光器,，這通常是一個(gè)復(fù)雜的,，有時(shí)甚至是不可能完成的任務(wù)。傅里葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒激光器（例如鈦寶石飛秒激光器,、920nm光纖飛秒激光器）的光譜寬度通常在10~20nm范圍內(nèi),，它們只能同時(shí)激發(fā)激發(fā)光譜在10~20nm光譜范圍內(nèi)的熒光團(tuán)。因此,，若想用單臺(tái)激光器去同時(shí)激發(fā)更多種類(lèi)的熒光團(tuán)就需要帶寬更寬,，脈沖更短的激光器。
SCH寬光譜飛秒激光器在提供15fs脈沖寬度的同時(shí)以1050nm為中心波長(zhǎng)提供200nm的帶寬,，在這個(gè)帶寬范圍內(nèi) （橫跨900到1200nm）的所有綠色和紅色的熒光團(tuán)都可以同時(shí)被這種激光器激發(fā),。這對(duì)于雙光子顯微鏡來(lái)說(shuō)，同時(shí)對(duì)多個(gè)熒光團(tuán)成像成為一個(gè)可行的,，實(shí)用的和簡(jiǎn)單的替代,。
圖5：常見(jiàn)熒光探針激發(fā)波長(zhǎng)
圖6：小鼠腸道的雙光子熒光顯微鏡圖像
用Sytox Green標(biāo)記細(xì)胞核（洋紅色），F(xiàn)ITC濾波器,；用Alexa Fluor 568 Phaloidin標(biāo)記肌動(dòng)蛋白絲（綠色）,，TRITC過(guò)濾器,。兩種熒光標(biāo)記物同時(shí)被SCH激光器激發(fā)，用尼康的熒光濾片組過(guò)濾熒光,。
Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain.
綜上所述,，F(xiàn)YLA公司推出的新型、緊湊而強(qiáng)大的SCH全光纖飛秒激光器激光器,，提供15fs的脈沖持續(xù)時(shí)間和高峰值功率（>200kW）,，為體內(nèi)樣本的低光損傷激發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。結(jié)合全光纖激光器的緊湊性和堅(jiān)固性性,，SCH飛秒激光器成為雙光子顯微鏡的特殊激光選擇,。
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