代謝在細(xì)胞和生理過程中的作用已經(jīng)很明確,，現(xiàn)在認(rèn)為許多疾病都與代謝功能障礙或重編程有關(guān),。安捷倫 Seahorse XF 技術(shù)簡化了細(xì)胞能量代謝分析,。該技術(shù)利用免標(biāo)記方法實(shí)時(shí)測(cè)量活細(xì)胞的兩條能量代謝通路,，量化細(xì)胞代謝表型,，從而分析細(xì)胞功能的變化,。

XF 技術(shù)通過測(cè)定氧氣消耗速率(Oxygen Consumption Rate, OCR)來反映細(xì)胞線粒體的功能,，通過測(cè)定細(xì)胞外酸化速率(Extra Cellular Acidification Rate，ECAR)來反映糖酵解功能,。

將細(xì)胞接種到孔中,，并可以將較多四種藥物（例如抑制劑或激動(dòng)劑）自動(dòng)添加到細(xì)胞中。在探針板中,，每個(gè)探針?biāo)闹芘帕辛怂膫€(gè)集成的加藥口,。將藥物依次注入孔中，并通過探針與檢測(cè)液混合,。實(shí)時(shí)測(cè)定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝動(dòng)態(tài)變化,。

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Qustions&解答Answers

Seahorse XF 實(shí)驗(yàn)常見問題及解答

01可以使用超出保質(zhì)期的探針板或重復(fù)使用探針板嗎,？

Agilent 無法保證因使用超出保質(zhì)期的探針板或重復(fù)使用探針板而得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量(有效性)，為得到較佳的,、較真實(shí)的數(shù)據(jù),，請(qǐng)使用有效期內(nèi)的探針板及其它消耗品。

02探針板水化超出水化時(shí)間怎么辦,？

Agilent建議將探針板放入37℃無CO2培養(yǎng)箱中水化過夜以得到較優(yōu)結(jié)果,。較短水化時(shí)間是37℃水化12小時(shí)。探針板較長水化時(shí)間是37℃水化72小時(shí),，但由于液體蒸發(fā)需要補(bǔ)充(或更換)校準(zhǔn)液,，因此37℃無CO2培養(yǎng)箱務(wù)必放置水盤保證濕度。

03Fluxpak各種探針板有什么區(qū)別,？

探針板是Fluxpak的組成部分,，一個(gè)Fluxpak包含探針板、水化板,、校準(zhǔn)液和細(xì)胞培養(yǎng)微孔板,。以上各消耗品數(shù)量因所購Fluxpak類型而不同。探針板不能單獨(dú)訂購,，必須通過訂購Fluxpak來購買,，但細(xì)胞培養(yǎng)板和校準(zhǔn)液可單獨(dú)購買。訂購前,，需要了解使用機(jī)器的型號(hào)及所需要的實(shí)驗(yàn)次數(shù),，訂購與之配套的Fluxpak。

04計(jì)劃明天做實(shí)驗(yàn),，我今天要做些啥,？

實(shí)驗(yàn)前一天，打開主機(jī),，打開電腦,，同時(shí)點(diǎn)開Wave軟件，確保是Connected的狀態(tài),，水化探針板,，貼壁細(xì)胞提前接種到Seahorse的細(xì)胞培養(yǎng)板里。

05探針板水化聽說有二步,，是這樣嗎,？

是的，96孔探針板,，實(shí)驗(yàn)前一天,，用無菌水；第二天做實(shí)驗(yàn)前,，棄去無菌水,，更換上37℃預(yù)熱好的校準(zhǔn)液,，再放置無CO2恒溫箱孵育1小時(shí)，這樣二步法水化,，較大程度避免了探針頭上的小氣泡,；24機(jī)型探針板一步法水化即可，但是還是建議用之前手動(dòng)排一下氣泡,；

06一次實(shí)驗(yàn)可以只使用探針板其中的一部分嗎,？

為了將所有藥物或化合物成功地注入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，Agilent建議水化整個(gè)探針板并因需要將相同字母標(biāo)注的全部加藥孔注入藥物（請(qǐng)參考實(shí)驗(yàn)流程中關(guān)于加載藥物的注意事項(xiàng)）,。背景孔的加藥孔也必須加上藥物,，保證所有的A加藥孔體積一致，B,、C,、D孔同理，否則會(huì)造成打藥失??；

07實(shí)驗(yàn)中為何必須設(shè)置背景校正孔？

背景校正孔被用來過濾掉實(shí)驗(yàn)的干擾因素,，比如溫度和 buffering capacity,，這些干擾因素會(huì)影響氧含量和pH變化（非來源于代謝變化的影響）。背景校正孔還能被用來修正整板間溫度波動(dòng),，來診斷潛在溫度問題,，以及作為實(shí)驗(yàn)獲得非期望數(shù)據(jù)時(shí)原因篩查的切入點(diǎn)。

08背景校正孔怎么設(shè)置,？

背景校正孔里除了沒有細(xì)胞,，其它所有操作和細(xì)胞孔一致。96機(jī)型背景校正孔（A1,A12, H1, H12,，即4個(gè)角）不接種細(xì)胞,；24機(jī)型背景校正孔設(shè)置為（A1, B4, C3, D6）,；確保背景校正孔中只加入培養(yǎng)液（無細(xì)胞）

09為何細(xì)胞培養(yǎng)板需要在 37℃無CO2 培養(yǎng)箱中放置45-60min,？

細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃無CO2培養(yǎng)箱中孵育45-60min的目的是為了脫氣，釋放CO2,。

10 Seahorse 實(shí)驗(yàn)時(shí),，我擔(dān)心細(xì)胞量少，我多種點(diǎn)細(xì)胞可以嗎,？

細(xì)胞的密度需要摸索,，在實(shí)驗(yàn)上機(jī)前，長滿板底面積80-90%為較佳,，設(shè)置一個(gè)密度梯度,，找到較佳的密度,；細(xì)胞過密會(huì)使檢測(cè)時(shí)形成的瞬間微室氧氣快速耗盡。

11 Seahorse 實(shí)驗(yàn),，種細(xì)胞和平時(shí)種細(xì)胞有區(qū)別嗎,？

安捷倫細(xì)胞培養(yǎng)板種細(xì)胞時(shí)候，槍頭抵壁,，與水平面呈45°角度加入,，加完在超凈臺(tái)靜置1小時(shí)，有助于促進(jìn)細(xì)胞均勻分布并減少邊緣效應(yīng),。96孔細(xì)胞板種80ul,；24機(jī)型的板子分二步，先每孔接種100 μL細(xì)胞懸液,，培養(yǎng)細(xì)胞1-6小時(shí),，細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)充生長培養(yǎng)基,，每孔加入150μL生長培養(yǎng)液,總體積為250 μL,。加液時(shí)沿壁輕輕加入，避免吹起剛貼壁的細(xì)胞,。

12 使用組織黏附劑處理細(xì)胞培養(yǎng)板會(huì)影響XF實(shí)驗(yàn)測(cè)量嗎,？

不會(huì)。使用諸如poly-L-Lysine,，fibronectin,，Gelatin，poly-D-lysine,，Cell-Tak™等組織黏附劑處理細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí),，不會(huì)影響XF儀器測(cè)量的效果及實(shí)驗(yàn)參數(shù)分析。

13 XFp/XFe96細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的每個(gè)細(xì)胞孔的較大體積及底面積是多少,？

275 µL,；底面積是正常96孔板底面積的40%。

14 XFe24細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的每個(gè)細(xì)胞孔的較大體積及底面積是多少,？

1000 µL,；底面積和正常96孔板底面積一樣大小。

15 Seahorse XF檢測(cè)液中需要加入抗生素嗎,？

無需加入抗生素,，因?yàn)榇蟛糠諼F實(shí)驗(yàn)在幾小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。

16可以在Seahorse檢測(cè)液中加入血清嗎,？

不建議加入血清（如：FBS）,，因?yàn)槠鋾?huì)影響檢測(cè)液的緩沖能力，并可能與進(jìn)行檢測(cè)的藥物/化合物發(fā)生非特異性結(jié)合而影響檢測(cè)效果，同時(shí)容易產(chǎn)生氣泡,。另外,，使用加入血清的檢測(cè)液溶解藥物加載至探針板加藥孔中進(jìn)行注射時(shí)，會(huì)出現(xiàn)漏藥或加藥注射失敗,。

17加入底物的檢測(cè)液在多長時(shí)間內(nèi)可保持穩(wěn)定,？或可以提前配好檢測(cè)液和藥物嗎？

Seahorse檢測(cè)液在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天現(xiàn)用現(xiàn)配,。藥物也要現(xiàn)配現(xiàn)用,，溶解后的藥物要一次性用完，剩余的也不能用于下次實(shí)驗(yàn)了,。

18 Seahorse XF糖酵解壓力試劑盒中的藥物狀態(tài)看上去很奇怪,，是否有質(zhì)量問題（或其他試劑盒中部分藥物）？

如Glycolysis stress test kit中的2-DG,，該藥可能是透明的液體,、不透明的（白色的）固體，也可能是白色固體與透明液體的混合物,，以上藥物狀態(tài)均不影響其性能,，可按照說明書正常溶解使用。

19使用pH 7.4 的 XF DMEM 或 RPMI 基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備檢測(cè)液時(shí),，加上Seahorse的三個(gè)底物,，是否就無需調(diào)整pH了？

是的,。使用推薦的 XF 三個(gè)底物,，能確保分析培養(yǎng)基較終 pH 值的準(zhǔn)確。如果使用其他供應(yīng)商提供的其他品牌的補(bǔ)充劑,，則無法保證培養(yǎng)基pH 值的準(zhǔn)確,。啟封后的pH7.4的DMEM或RPMI基礎(chǔ)培養(yǎng)基，盡可能在一個(gè)月內(nèi)用完,，以免pH值因?yàn)榭諝庵械腃O2進(jìn)去,，影響pH值。

20Seahorse的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與其他廠家的有啥不同,？

Seahorse XF 培養(yǎng)基專用于 XF 分析,，推薦研究者使用，以獲得較佳試驗(yàn)結(jié)果,。XF 培養(yǎng)基以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基組分（DMEM 或 PRMI）為基礎(chǔ),，做了以下這些方面改進(jìn)：

無碳酸氫鹽和低緩沖容量：利于細(xì)胞外酸化率的檢測(cè)

無底物添加：適用于用戶的各種不同需求

低濃度酚紅或無酚紅：確保 pH 值測(cè)量的準(zhǔn)確性

21請(qǐng)問進(jìn)行FAO實(shí)驗(yàn)時(shí),，能夠在探針板上加載BSA-palmitate使其在上機(jī)測(cè)量時(shí)自動(dòng)注射入細(xì)胞孔嗎,？

Agilent建議將BSA-palmitate或相似底物在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)做預(yù)處理。如果實(shí)驗(yàn)存在合理依據(jù)需在上機(jī)測(cè)量時(shí)通過注射加BSA-palmitate,、血清或其他類似底物,，請(qǐng)聯(lián)系相關(guān)技術(shù)支持,。

22 為何不能使用XF base medium配制的檢測(cè)液進(jìn)行Glycolytic rate與real-time ATP rate兩個(gè)實(shí)驗(yàn)？

XF base medium中含有酚紅,，該物質(zhì)會(huì)影響這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的測(cè)量,。

23 為何不能使用GlutaMAX來代替Glutamine呢？

不建議使用GlutaMAX來配制檢測(cè)液,。因加入GlutaMAX后,，還需細(xì)胞進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化為glutamine，這可能會(huì)影響線粒體對(duì)Glutamine氧化的動(dòng)力學(xué)過程,。

24 檢測(cè)液的pH對(duì)XF實(shí)驗(yàn)非常重要嗎,？

是的，Seahorse XF實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定細(xì)胞代謝物（如：氧和質(zhì)子）的變化來確定OCR 和ECAR,，而檢測(cè)液pH會(huì)影響這些代謝物的產(chǎn)生或消耗,，因此保持檢測(cè)液一致的 pH（37℃，pH=7.4± 0.1）非常重要,。

25 FluxPak中的水化板可以替代細(xì)胞培養(yǎng)板嗎,？

不可以，雖然水化板與細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)相同,，但不能用來培養(yǎng)細(xì)胞,。

26 Seahorse 探針板上機(jī)前加藥，需要注意什么,？

加藥時(shí)同樣方法,，槍頭抵著加藥孔壁大約與水平面呈45°度角，將液體一次性加入到加藥孔中,，注意板子始終保持在平面上,，加完藥的探針板不能晃動(dòng)，以免加入的液體漏入水化板中,。（24的機(jī)型,，在加藥前需要取下粉色的水化輔助板）；

27 Seahorse 細(xì)胞板上機(jī)時(shí)候,，放進(jìn)去應(yīng)該就可以了,？

探針板和細(xì)胞板放入儀器時(shí)，朝向?yàn)锳1孔朝向機(jī)器內(nèi)部,，記得把蓋子拿掉,；

28 Seahorse XF報(bào)告生成器中的代謝數(shù)據(jù)是如何計(jì)算的？

在每個(gè)試劑盒的Seahorse XF報(bào)告生成器的用戶指南中詳細(xì)列出了數(shù)據(jù)的計(jì)算公式,，請(qǐng)參閱,。

29 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件Wave可以免費(fèi)下載安裝嗎？

是的，可在安捷倫找到Wave軟件下載,，并且免費(fèi)下載安裝,。

30 Seahorse XF 儀器模板選項(xiàng)中沒有想檢測(cè)試劑盒的模板怎么辦？

可在桌面板wave軟件中將相應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)０逑葘?dǎo)出到 U 盤中,，再導(dǎo)入XF 儀器模板庫即可,。

31 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件導(dǎo)出選項(xiàng)中沒有對(duì)應(yīng)的report generator？

當(dāng)軟件導(dǎo)出選項(xiàng)中無相應(yīng)的report generator時(shí),，請(qǐng)移步到Agilent細(xì)胞分析軟件下,，下載較新wave分析軟件，也可以在對(duì)應(yīng)試劑盒的菜單中下載對(duì)應(yīng)的report generator,。

32 Seahorse Wave 分析軟件,，我的電腦怎么都安裝不上，怎么辦,？

當(dāng)軟件無法安裝時(shí),，可采用 Seahorse Analytics云分析， 這是一款網(wǎng)頁形式的 Seahorse XF 數(shù)據(jù)分析軟件,，用戶可以通過任何一臺(tái)電腦安全地存儲(chǔ),、訪問和分析數(shù)據(jù)。極大地簡化了用戶的數(shù)據(jù)分析流程

33 Seahorse XF 實(shí)驗(yàn)后,，是否需要做歸一化處理呢,，有哪些方法呢？

功能生物數(shù)據(jù)的歸一化是原始數(shù)據(jù)展示和后續(xù)分析工作流程中的關(guān)鍵因素,，以確保對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確一致的解析,。XF 代謝分析在這方面也是如此，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行某種形式的歸一化,。無論是比較不同的細(xì)胞類型,、基因修飾還是化合物處理，都必須根據(jù)共同的參數(shù)將數(shù)據(jù)歸一化以便正確比較,。

常用的方法,，蛋白定量，細(xì)胞成像計(jì)數(shù),，核DNA的檢測(cè)等,。

34 購買的Fluxpak包裝，為啥細(xì)胞板總是多幾塊呢,？

Agilent 充分考慮到實(shí)驗(yàn)中的各種情況,，如果你發(fā)現(xiàn)細(xì)胞種的過密了或者發(fā)生了污染，那么就需要更換新的細(xì)胞板重新鋪板,。

35 Seahorse相關(guān)試劑存儲(chǔ)條件是怎么的呢,？

Agilent 基礎(chǔ)培養(yǎng)基類,，請(qǐng)4℃避光保存，避免凍結(jié),。FAO和谷氨酰胺需要存放在-20℃；板子及常見的試劑盒,，室溫存儲(chǔ)即可,。

36 Seahorse XF 相關(guān)試劑盒的說明書在哪呢，有中文的嗎,？

Agilent 一直提倡遵循環(huán)保理念,，當(dāng)您收到試劑盒后，標(biāo)簽面都有一個(gè)二維碼,，掃描即可下載說明書,。部分有中文說明書，請(qǐng)聯(lián)系相關(guān)技術(shù)支持索取,。

37 Seahorse XFe24 組織胰島板能簡單介紹下嗎,？

目前只要24機(jī)型配有組織胰島微孔板，其微孔板的腔室容積為16.6 µL,；

其網(wǎng)狀捕獲篩孔徑為125 µm,。

38 Seahorse 啥數(shù)據(jù)能大致判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果靠譜不？

通過大量的結(jié)果數(shù)據(jù),，24機(jī)型基礎(chǔ)OCR值范圍50～400(pmol/min),，基礎(chǔ)ECAR值范圍20～120(mpH/min)；96機(jī)型基礎(chǔ)OCR值 范圍20～160(pmol/min),，基礎(chǔ)ECAR值范圍10～90(mpH/min),。這個(gè)范圍內(nèi)的值，還是比較靠譜的,。