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上海徠同生物科技有限公司

美國(guó)Azaood公司Fast One Step Cloning Kit REF代理

時(shí)間:2023-11-28閱讀:193
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型號(hào): AZ00008 


儲(chǔ)運(yùn)條件

-20℃

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

基于重組原理的無(wú)縫克隆技術(shù),,作為新一代的克隆方法,,不依賴繁瑣的酶切、連接步驟,也不需要末端補(bǔ)平等操作,,依據(jù)DNA 片段與線性化載體末端的15~25 nt 同源序列的重組,,可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn),,載體自連背景低,,是一種簡(jiǎn)單、快速的DNA 定向克隆技術(shù),。

Fast One Step Cloning Kit 無(wú)縫克隆試劑盒,,一次反應(yīng)可完成單至多個(gè)DNA 片段的重組,快僅需5 分鐘即可完成單片段重組,,且陽(yáng)性率高于95%,。Kit 中添加的輔助因子,有效提高克隆陽(yáng)性率,;經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系,能夠一定程度上耐受未純化PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì),。升版的無(wú)縫克隆試劑盒具有更高的陽(yáng)性率,、更好的兼容性。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 實(shí)驗(yàn)流程概要

2. 線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點(diǎn),,對(duì)載體進(jìn)行線性化,,載體的線性化可以通過(guò)酶切或反向PCR 擴(kuò)增完成。

① 酶切制備

一些限制性內(nèi)切酶不能有效地消化超螺旋DNA,,因此可能會(huì)留下不同數(shù)量的未切割載體DNA,,降低陽(yáng)性率,。推薦使用LightNingTM 快速內(nèi)切酶進(jìn)行酶切(單酶切或者雙酶切),使載體線性化wanquan,,以降低轉(zhuǎn)化背景(未切割的載體轉(zhuǎn)化獲得的假陽(yáng)性克?。?/p>

注1:經(jīng)酶切進(jìn)行線性化的載體無(wú)需去磷酸化,,推薦使用雙酶切,。

注2:酶切完成后,建議將內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后用于重組反應(yīng),。

② 反向PCR 擴(kuò)增制備

為減少擴(kuò)增突變的引入,,推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板,,以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對(duì)克隆陽(yáng)性率的影響,。

注1:PCR 產(chǎn)物無(wú)非特異性條帶時(shí), 推薦使用Template Eliminator( 貨號(hào):EG21203)消化質(zhì)粒模板即可用于重組反應(yīng),;反之建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用,。

注2:多片段克隆時(shí),建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用,。

3. 插入片段PCR 引物設(shè)計(jì)

PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段(插入片段或載體)末端同源的15~25 nt(推薦18 nt)序列,。假如載體為粘性末端,且3' 端突出,,則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分,;若5' 端突出,則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分,,也可以不包含,。

插入片段正向擴(kuò)增引物:

5'—上游載體末端同源序列+ 酶切位點(diǎn)(可選)+ 基因特異性正向擴(kuò)增序列— 3'

插入片段反向擴(kuò)增引物:

3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+ 酶切位點(diǎn)(可選)+ 下游載體末端同源序列—5'

注1:盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆,當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為40%~60% 時(shí),,重組效率高,;

注2:本試劑盒所提供的pUC 19 載體(Ampr)連接端序列如下:

4. 插入片段的PCR 擴(kuò)增

推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增,以減少擴(kuò)增突變的引入,。建議使用純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫克隆反應(yīng),,若PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,可直接使用,,但加樣體積不應(yīng)超過(guò)總反應(yīng)體積的20%,。

5. 重組反應(yīng)

① 于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系:

a. 適載體用量(ng) = 0.02 × 載體堿基對(duì)數(shù),即0.03 pmol,。

b. 插入單片段,,適片段用量(ng)= 0.04 × 片段堿基對(duì)數(shù);插入多片段,,每片段適用量(ng)= 0.02 × 片段堿基對(duì)數(shù),。

注1:若插入單片段的長(zhǎng)度大于載體,,則應(yīng)互換載體與插入片段用量;

注2:若插入片段的長(zhǎng)度小于200 bp,,則插入片段應(yīng)使用5 倍載體用量,;

注3:若按上述公式計(jì)算得到的用量超過(guò)低/ 高值,則建議直接按低/ 高用量使用,;

注4:載體片段過(guò)長(zhǎng),、插入片段過(guò)長(zhǎng)或片段數(shù)過(guò)多,克隆陽(yáng)性率均會(huì)降低,。

重組反應(yīng)體系配制完成后,,用移液槍輕輕吸打混勻各組分,避免產(chǎn)生氣泡,,切勿渦旋,。

② 將反應(yīng)體系置于50℃,反應(yīng)5~60 min,。

注1:推薦使用 PCR 儀等溫控比較jingzhun的儀器進(jìn)行反應(yīng),,反應(yīng)時(shí)間不足或太長(zhǎng)克隆效率均會(huì)降低;

注2:插入1~2 個(gè)片段時(shí),,推薦反應(yīng)時(shí)間為5~15 min,;插入3~5 個(gè)片段時(shí),推薦反應(yīng)時(shí)間為15~30 min,;

注3:當(dāng)載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時(shí),,建議延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到30~60 min;

注4:50℃反應(yīng)完成后,,建議進(jìn)行瞬時(shí)離心,,將反應(yīng)液收集至管底。

③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻,,之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲(chǔ)存于 -20℃,。

注 1: -20℃儲(chǔ)存的重組產(chǎn)物,建議在 1 周內(nèi)使用,。

6. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取5~10 μl 反應(yīng)液,,加入到100 μl 感受態(tài)細(xì)胞中,緩慢吸打混勻,,冰上放置30 min,。42℃ 熱激45~60 sec,,冰浴5 min,。加500 μl SOC或 LB 培養(yǎng)基,,37℃ 振蕩培養(yǎng)40~60 min(200 rpm)。將菌液均勻涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素的平板上,,倒置于37℃ 過(guò)夜培養(yǎng),。

注1:不同感受態(tài)細(xì)胞后的克隆陽(yáng)性率會(huì)有所差別,推薦使用轉(zhuǎn)化效率 > 108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞,;

注2:菌落數(shù)取決于PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度;

注3:陽(yáng)性對(duì)照平板通常生長(zhǎng)大量白色單菌落,,陰性對(duì)照平板只生長(zhǎng)很少的菌落。

7. 陽(yáng)性克隆檢測(cè)

挑取單菌落至10 μl ddH2O 中混勻,95℃裂解10 min 后,,取1 μl裂解液作為模板,,進(jìn)行菌落PCR 鑒定,,或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后,,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,。

陽(yáng)性對(duì)照的陽(yáng)性克隆檢測(cè),,菌落PCR 引物使用通用引物M13F 與M13R,,酶切鑒定用HindIII 與EcoRI。

注1:菌落PCR 時(shí)建議至少使用一條通用引物,,避免假陽(yáng)性結(jié)果,;

注2:必要時(shí)可進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序鑒定,。

注3:M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R:CAGGAAACAGCTATGAC


原創(chuàng)作者:上海創(chuàng)凌生物科技有限公司



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