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型號: AZ00008
儲運條件
-20℃
產(chǎn)品組成
產(chǎn)品簡介
基于重組原理的無縫克隆技術(shù),,作為新一代的克隆方法,不依賴繁瑣的酶切,、連接步驟,,也不需要末端補平等操作,依據(jù)DNA 片段與線性化載體末端的15~25 nt 同源序列的重組,,可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點,,載體自連背景低,是一種簡單,、快速的DNA 定向克隆技術(shù),。
Fast One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒,一次反應(yīng)可完成單至多個DNA 片段的重組,,快僅需5 分鐘即可完成單片段重組,,且陽性率高于95%。Kit 中添加的輔助因子,,有效提高克隆陽性率,;經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系,能夠一定程度上耐受未純化PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì),。升版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率,、更好的兼容性。
實驗步驟
1. 實驗流程概要
2. 線性化克隆載體制備
選擇合適的克隆位點,,對載體進(jìn)行線性化,,載體的線性化可以通過酶切或反向PCR 擴增完成,。
① 酶切制備
一些限制性內(nèi)切酶不能有效地消化超螺旋DNA,因此可能會留下不同數(shù)量的未切割載體DNA,,降低陽性率,。推薦使用LightNingTM 快速內(nèi)切酶進(jìn)行酶切(單酶切或者雙酶切),使載體線性化wanquan,,以降低轉(zhuǎn)化背景(未切割的載體轉(zhuǎn)化獲得的假陽性克?。?/p>
注1:經(jīng)酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化,,推薦使用雙酶切,。
注2:酶切完成后,建議將內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后用于重組反應(yīng),。
② 反向PCR 擴增制備
為減少擴增突變的引入,,推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板,,以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響,。
注1:PCR 產(chǎn)物無非特異性條帶時, 推薦使用Template Eliminator( 貨號:EG21203)消化質(zhì)粒模板即可用于重組反應(yīng),;反之建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用,。
注2:多片段克隆時,建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用,。
3. 插入片段PCR 引物設(shè)計
PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段(插入片段或載體)末端同源的15~25 nt(推薦18 nt)序列,。假如載體為粘性末端,且3' 端突出,,則引物設(shè)計必須包含突出部分,;若5' 端突出,則引物設(shè)計可以包含突出部分,,也可以不包含,。
插入片段正向擴增引物:
5'—上游載體末端同源序列+ 酶切位點(可選)+ 基因特異性正向擴增序列— 3'
插入片段反向擴增引物:
3'—基因特異性反向擴增序列+ 酶切位點(可選)+ 下游載體末端同源序列—5'
注1:盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆,當(dāng)載體克隆位點上下游25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為40%~60% 時,,重組效率高;
注2:本試劑盒所提供的pUC 19 載體(Ampr)連接端序列如下:
4. 插入片段的PCR 擴增
推薦使用高保真PCR Mix 進(jìn)行擴增,,以減少擴增突變的引入,。建議使用純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng),若PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產(chǎn)物,,可直接使用,,但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%。
5. 重組反應(yīng)
① 于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系:
a. 適載體用量(ng) = 0.02 × 載體堿基對數(shù),,即0.03 pmol,。
b. 插入單片段,,適片段用量(ng)= 0.04 × 片段堿基對數(shù);插入多片段,,每片段適用量(ng)= 0.02 × 片段堿基對數(shù),。
注1:若插入單片段的長度大于載體,則應(yīng)互換載體與插入片段用量,;
注2:若插入片段的長度小于200 bp,,則插入片段應(yīng)使用5 倍載體用量;
注3:若按上述公式計算得到的用量超過低/ 高值,,則建議直接按低/ 高用量使用,;
注4:載體片段過長、插入片段過長或片段數(shù)過多,,克隆陽性率均會降低,。
重組反應(yīng)體系配制完成后,用移液槍輕輕吸打混勻各組分,,避免產(chǎn)生氣泡,,切勿渦旋。
② 將反應(yīng)體系置于50℃,,反應(yīng)5~60 min,。
注1:推薦使用 PCR 儀等溫控比較jingzhun的儀器進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)時間不足或太長克隆效率均會降低,;
注2:插入1~2 個片段時,,推薦反應(yīng)時間為5~15 min;插入3~5 個片段時,,推薦反應(yīng)時間為15~30 min,;
注3:當(dāng)載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時,建議延長反應(yīng)時間到30~60 min,;
注4:50℃反應(yīng)完成后,,建議進(jìn)行瞬時離心,將反應(yīng)液收集至管底,。
③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻,,之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲存于 -20℃。
注 1: -20℃儲存的重組產(chǎn)物,,建議在 1 周內(nèi)使用,。
6. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
取5~10 μl 反應(yīng)液,加入到100 μl 感受態(tài)細(xì)胞中,,緩慢吸打混勻,,冰上放置30 min。42℃ 熱激45~60 sec,,冰浴5 min,。加500 μl SOC或 LB 培養(yǎng)基,,37℃ 振蕩培養(yǎng)40~60 min(200 rpm)。將菌液均勻涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上,,倒置于37℃ 過夜培養(yǎng),。
注1:不同感受態(tài)細(xì)胞后的克隆陽性率會有所差別,推薦使用轉(zhuǎn)化效率 > 108 CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞,;
注2:菌落數(shù)取決于PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度,;
注3:陽性對照平板通常生長大量白色單菌落,陰性對照平板只生長很少的菌落,。
7. 陽性克隆檢測
挑取單菌落至10 μl ddH2O 中混勻,,95℃裂解10 min 后,取1 μl裂解液作為模板,,進(jìn)行菌落PCR 鑒定,,或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,。
陽性對照的陽性克隆檢測,,菌落PCR 引物使用通用引物M13F 與M13R,酶切鑒定用HindIII 與EcoRI,。
注1:菌落PCR 時建議至少使用一條通用引物,,避免假陽性結(jié)果;
注2:必要時可進(jìn)一步對陽性結(jié)果進(jìn)行測序鑒定,。
注3:M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R:CAGGAAACAGCTATGAC
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