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DLA檢測雙熒光素酶檢測報(bào)告的實(shí)驗(yàn)步驟介紹

時(shí)間:2023-2-9閱讀:173
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實(shí)驗(yàn)原理

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特點(diǎn),,把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因(firefly luciferase)的上游,,構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,,適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞,,測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷性刺前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響,。

同時(shí),,為了減少內(nèi)在的變化因素對實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響,將帶有海腎熒光素酶基因(Rinilla luciferase)的質(zhì)粒作為對照質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,,提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照,,使測試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。

實(shí)驗(yàn)操作步驟:

DLA檢測

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代

1) 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞,,評估細(xì)胞匯合的程度以及確認(rèn)無細(xì)菌和真菌污染,;

2) 移去培養(yǎng)皿(瓶)中的培養(yǎng)液;

3) 加入相當(dāng)于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細(xì)胞,,一般三次即可,;

4) 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%胰酶消化單層細(xì)胞。搖晃培養(yǎng)皿(瓶)使其胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞單層,,倒出多余的胰蛋白酶,;

5) 將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱,放置2-10 min;

6) 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞以確保所有細(xì)胞都分離且漂浮,,輕拍培養(yǎng)皿(瓶)的一側(cè)來釋放殘留的貼壁細(xì)胞,;

7) 用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以滅活胰蛋白酶,取出100-200μl用于計(jì)數(shù),;

8) 將所需數(shù)量的細(xì)胞移至一個(gè)新標(biāo)記好的溫育過培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(瓶)中,;選擇適當(dāng)培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞系;

9) 按照細(xì)胞系的生長特性重復(fù)該步驟,知道細(xì)胞狀態(tài)良好,、無污染,,可以鋪板使用,其余選擇凍存,。

2. 活細(xì)胞計(jì)數(shù)

1) 取一瓶傳代的細(xì)胞,,待長成單層以后使用;細(xì)胞懸液的制備方法:用0.25%的胰酶消化,、PBS洗滌后,,加入培養(yǎng)液吹打制成待測細(xì)胞懸液。

2) 蓋好蓋玻片,,取一套血球計(jì)數(shù)槽,,制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液:用吸管吸適量細(xì)胞懸液到離心管中,加入等體積臺盼藍(lán)染液,,加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞,。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),不考慮細(xì)胞的活力,,則可不使用臺盼藍(lán)染色,。

3) 將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板,注意蓋玻片下不要有氣泡,,也不要懸液流入旁邊槽中,。

4) 統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù),將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,,并移動計(jì)數(shù)板,,當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后,數(shù)出四角的大格(每格含有16個(gè)中格)中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目,。

5) 計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù),。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度:

6) (細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml = (四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×104

3. Dual-Luciferase® Reporter Assay試劑盒檢測步驟

1) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:按照上述實(shí)驗(yàn)分組的情況,采用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒的方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,,轉(zhuǎn)染12小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基,;

2) 樣品裂解:轉(zhuǎn)染72小時(shí)后PBS清洗細(xì)胞兩次,每孔加入250ul 1×PLB裂解液,,搖床上裂解細(xì)胞,;

3) 樣品檢測:在96孔黑色板中加入100ul的LAR II試劑,后加入20ul的裂解液后檢測讀數(shù),;

4) 內(nèi)參檢測:10s內(nèi)加入100ul的Stop & Glo底物,,檢測讀數(shù);

5) 結(jié)果分析:導(dǎo)出數(shù)據(jù)后采用GraphPad prism 5軟件進(jìn)行結(jié)果分析并制圖,;


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