自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程,，藉此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新,。

標記及追蹤LC3以及自噬流的變化,。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白,，而mRFP是穩(wěn)定的熒光表達基團,，不受外界影響。由于自噬小體進入第二階段后，與溶酶體進行融合,，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體由于溶酶體內部的酸性環(huán)境,，可以導致PH下降,，GFP淬滅，因此,，GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度,，GFP越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢,。反之,，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻,。mRFP是一直穩(wěn)定表達的,，因而可以通過GFP與mRFP的亮點比例來評價自噬流進程。

實驗方法

Step1：細胞培養(yǎng)

Step2：轉染或藥物處理

Step3：細胞收集

Step4：添加LC3-GFP-RPF病毒感染

Step5：熒光檢測

結果展示

自噬流

自噬誘導劑

a)Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激

b)Carbamazepine/ L-690,，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase,，肌醇單磷酸酶）

c)Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

d)N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

e)Rapamycin：mTOR抑制劑

f)Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

自噬抑制劑

a)3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

b)Bafilomycin A1：質子泵抑制劑

c)Hydroxychloroquine（羥氯喹）

自噬的評估通常采用多個自噬階段的標志物，因為自噬小體數量的增加可能是自噬上調也可能是自噬階段降解被抑制所致,，所以設置合適的對照很有必要,。

1. 透射電鏡

2. WB檢測標志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1

3. WB檢測Lamps、Atg5,、Atg14和Beclin-1

4. 組織蛋白酶Cathepsin活力檢測

5. IF檢測自噬流auhagicflux