產(chǎn)品貨號: B-P-00003-2,、B-P-00003-4,、B-P-00003-10
產(chǎn)品規(guī)格: 2ml-kit、4ml-kit,、10ml-kit
產(chǎn)品品牌:Biozellen
Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠套裝
Biozellen®基質(zhì)膠 特點：
1,、100%植物源材料，無任何動物成分,；
2,、胺基酸序列100%人源化 ；
3,、可調(diào)控基質(zhì)膠硬度進行多種細胞培養(yǎng),；
4、3D細胞/類器官培養(yǎng)種類數(shù)量范圍更廣,；
5,、無人畜共通病原菌或毒素風險；
6,、用于醫(yī)療級生物原料,；
7、高活性,、高純度,、可融化；
8,、2年保存時間,；
9、3D培養(yǎng)結(jié)束后基質(zhì)膠可以溫和融化,，并保留3D細胞/類器官結(jié)構(gòu)完整性,；
Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠套裝
Catalog No. B-P-00003-2、B-P-00003-4,、B-P-00003-10
Specification 2ml-kit,、4ml-kit ,、10ml-kit
Storage Store at-20℃. 1年保存.
一、產(chǎn)品描述
Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠套裝包含整套基質(zhì)膠,、膠體固定液,、膠體溶解液，可應用到3D細胞培養(yǎng)與微環(huán)境應用等,；本試劑盒操作便利且可調(diào)控基質(zhì)膠硬度進行多種細胞培養(yǎng)測試,；植物膠體可快速形成水凝膠， 請操作前詳細閱讀此使用指南,。
（Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠材料為植物來源,，無動物成分）
二、應用
•3D類器官培養(yǎng),。
•3D細胞球體培養(yǎng)試驗
•細胞侵襲
•細胞遷移
•小鼠皮下成瘤
•適合用于3D細胞藥物篩檢平臺
•細胞生長和分化
•代謝/毒理學研究
•體外和體內(nèi)血管生成分析
三,、適用細胞種類
• 原代細胞 • 干細胞
四、試劑盒組分
五,、使用步驟：
A,、試劑制備
A基質(zhì)膠：將A基質(zhì)膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘， 確認*融解.
C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10X C緩沖溶液用冰的無細胞培養(yǎng)液(例如： 無血清DMEM,、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液,。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .
D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.
B、Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備
全部步驟需要在無菌環(huán)境內(nèi)操作,，操作步驟如下：
1. 將24孔培養(yǎng)板放置于冰箱或者冰上預冷,。
2. 細胞計數(shù)后取 2×105~2×107 細胞與 0.5ml 37℃ 培養(yǎng)基均勻混合，并與0.5ml 37℃ A膠按照 1:1 等比例均勻混合,，最終細胞密度1*105~1*107cells/mL。
注：請選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進行試驗,。
3.取 20-40 微升步驟 2 含細胞的混合 A 膠溶液滴于 步驟 1 預冷的培養(yǎng)板上,，膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠。 注: 測試膠體是否成膠,，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進行確認,。
4.待膠體成膠后，添加1毫升冰的1X C緩沖溶液,，并蓋過步驟3 的膠溶液,，固定 15 分鐘。
5.待15分鐘固定后,，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細胞生長之培養(yǎng)基溶液,。
6將含有細胞的膠于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進行7~14天的培養(yǎng)，并觀察細胞球體的形成,，按正常培養(yǎng)基更換頻率進行更換操作,。
C,、溶膠與收集細胞球體準備程序
小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用1X PBS進行清洗,。
小心的將 1X PBS 吸取移除,，并添加 1 毫升冰的D緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應 5分鐘,。
溫和的用1毫升移液管吸取,，直到膠滴*溶解。
將含有細胞球體的溶液吸入1.5 毫升離心管,，用1000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘,，移除上清液體并收集細胞球體做分析。
D,、收集單顆細胞準備程序
在分離單細胞前,，先按上述溶膠與收集細胞球體準備程序進行操作
1. 添加trypsin-EDTA并與收集的細胞球體于37°C混合反應,。
2. 用1毫升移液管混合,，直到細胞體*分解。
3. 待細胞球體*分解,，加入3倍體積的1X PBS,，并用1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進行離心10分鐘,，并移除上清液體收集沉淀的單細胞做分析。
六,、細胞侵襲實驗準備程序
A,、試劑準備:
1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用37 ℃水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM（不可以用PBS稀釋）等,，用于稀釋A膠) 稀釋C緩沖溶液 (10 X) (貨號: B-P-00003-C)至C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍,。使用前放置37度水浴槽。 (例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 如未使用完畢,，可保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)
2,、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號: B-P-00003-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認*溶解,。再將37 ℃水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液取 0.5 mL,，加至37 ℃已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)，配置成1 mL 的 A膠 (1X),。使用前置于37度,，可降低A膠黏度。(單次使用,，勿重復冷凍解凍 A膠 (1X) )
B,、細胞侵襲實驗步驟
1、準備適用24孔板的Transwell裝置(例如:康寧Transwell insert, 8 μm PET membrane),。
2,、用37 ℃已回溫的C緩沖溶液 (0.5 X)將A膠 (1X) 原液體積稀釋5-20倍,，建議一開始可選用15倍。 (根據(jù)細胞種類做稀釋比例對比實驗,，找出自己實驗體系的稀釋倍數(shù),，稀釋倍數(shù)越高，膠體越軟,，越容易穿透)
3,、根據(jù)Transwell上室底部面積加入步驟2的 0.1 mL 稀釋后的A膠稀釋液到Transwell上室中。
4,、將步驟4在 4 ℃ 冰箱孵育2-3小時,。
5、在Transwell上室中加入0.1 mL 無血清的細胞懸液,，使細胞最終濃度約7.5 x 104 cells/well.,。
6、在Transwell下室中加入0.8 mL 含10 %血清的細胞培養(yǎng)液做為chemoattractant,，吸引細胞進行遷移及分泌基質(zhì)蛋白酶 (MMP) 侵襲,。 (對照組為Transwell下室中加入含0.8ml無血清的細胞培養(yǎng)液)。
7,、將細胞培養(yǎng)板在37 ℃, 5 % CO2培養(yǎng)箱孵育24-48 小時,。
8、移除培養(yǎng)液,，以PBS 清洗2次,。
9、用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細胞,。
10,、加入1 ml 100 % 甲醇室溫固定30分鐘,再以PBS 清洗2次。
11,、加入 1 ml 0.1 % 結(jié)晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 結(jié)晶紫) 室溫染色20 分鐘,，再以PBS 清洗2次。
12,、將Transwell移至載玻片上，在顯微鏡下隨機6-9個視野觀察計算遷移的細胞數(shù),。
七,、小鼠皮下成瘤實驗準備程序
A、細胞房內(nèi)材料準備,、試劑制備及步驟
(1) 材料準備:
1. 冰盒,、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C緩沖溶液(10X),、4. 無血清細胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM,，DMEM-F12等,，不可用 PBS )、5. A膠 (2X),、6. 細胞培養(yǎng)液,、7. 23-26G針頭、8. 1 mL針筒,、9. 細胞,。
(2) 試劑制備:
1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃ 水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM或DMEM-F12等,，不可用 PBS ) 稀釋 C緩沖溶液 (10 X) 至 C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍,。使用前放置37度水浴槽。(例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 若未使用完畢,，可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)
2,、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號:B-P-00003-A) 置于37 ℃ 水浴槽回溫10分鐘，確認*溶解,。再將 37 ℃ 水浴回溫的無血清細胞培養(yǎng)液取 0.5 mL,， 加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)，配置成 1 mL 的 A膠 (1X),。使用前置于37度,，可降低黏度。 (單次使用,，勿重復冷凍解凍 A膠 (1X) )
(3)步驟:
1,、取細胞溶液離心后收集細胞沉淀，與C緩沖溶液 (0.5 X) 均勻混合使細胞濃度為3*106 cells/mL,。
2,、A膠 (1X) 與步驟 1 含 C緩沖溶液 (0.5 X) 的細胞系懸浮液，按照 2:1 比例均勻混合配置,，細胞懸浮液最終濃度為 106 cells/mL,。使用前置于37℃，可降低黏度,。 (C緩沖溶液用于A膠凝膠反應,，例如0.5ml C 緩沖溶液(0.5 X)含細胞 加入 1ml A膠 (1X) 混合成1.5ml 的注射液)
3、選用 23-26 G 的針頭 (建議選用 24 G) 及 1 mL 針筒,，抽取 步驟2 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液至所需注射體積 (例如:0.2-0.6 mL) ,。室溫37℃至20℃操作抽取。 (若抽取時發(fā)生塞針狀態(tài),，可先把針頭拔掉,，以針筒進行抽取，建議一次抽取配置好所需針筒數(shù)量,，避免步驟2 溶液過度凝膠,，發(fā)生塞針)
4,、將抽取好步驟 3 的針筒，帶入動物房, 若短時間無法施打建議置于冰上,。
B,、動物房內(nèi)材料準備及步驟
(1)材料準備:
1. 含 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液的針筒、2. 皮膚消毒劑 (例如 : 酒精),、
3. 手套,、4. 實驗小鼠、5. 麻醉小鼠的試劑
(2)步驟:
1,、室溫下可直接注射,。若是置于冰盒上的針筒，回到室溫后,，待液化再進行注射,。 含 A膠與 C緩沖溶液的細胞混合液的針筒，以皮下注射方式,，注射實驗所需的體積至實驗鼠 (建議皮下注射量為 0.2 mL,，實際狀況依需求而定)。(針筒放冰上注射阻力會上升, 放室溫會液化注射阻力小,。注射時若因凝膠緣故而阻力變大,，需緩慢注射避免針頭噴落)
注1 : 注射體積可依不同實驗目的做調(diào)整，若為皮下血管生成研究注射體積需至少0.5 mL以上,。
注2 : 此步驟依實驗需求可執(zhí)行或不執(zhí)行,，若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果，可調(diào)整2.試劑制備將C緩沖溶液 (10 X) 稀釋15倍,，變成C緩沖溶液 (0.66 X),，再執(zhí)行后續(xù)成膠實驗；提高C濃度,，可提高膠體硬度,。
2、培養(yǎng)一至三周后觀察量測接種的腫瘤尺寸,。
注3 : 若為血管生成研究,，應注射含VEGF及heparin的A膠，以促進血管生成,。約三天后,，可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。