實驗原理

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應的特點,，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游,，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞,，適當刺激或處理后裂解細胞,，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷性刺后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響,。

同時,，為了減少內(nèi)在的變化因素對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase)的質(zhì)粒作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞,，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照,，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。

試驗主要試劑

實驗操作步驟：

DLA檢測

1. 細胞培養(yǎng)及細胞傳代

1) 倒置顯微鏡觀察細胞,，評估細胞匯合的程度以及確認無細菌和真菌污染,；

2) 移去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液；

3) 加入相當于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細胞,，一般三次即可,；

4) 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%胰酶消化單層細胞。搖晃培養(yǎng)皿（瓶）使其胰蛋白酶覆蓋細胞單層,，倒出多余的胰蛋白酶；

5) 將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱,，放置2-10 min;

6) 用倒置顯微鏡觀察細胞以確保所有細胞都分離且漂浮,，輕拍培養(yǎng)皿（瓶）的一側(cè)來釋放殘留的貼壁細胞；

7) 用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細胞以滅活胰蛋白酶,，取出100-200μl用于計數(shù),；

8) 將所需數(shù)量的細胞移至一個新標記好的溫育過培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（瓶）中；選擇適當培養(yǎng)條件培養(yǎng)細胞系,；

9) 按照細胞系的生長特性重復該步驟,，知道細胞狀態(tài)良好、無污染,，可以鋪板使用,，其余選擇凍存,。

2. 活細胞計數(shù)

1) 取一瓶傳代的細胞，待長成單層以后使用,；細胞懸液的制備方法：用0.25%的胰酶消化,、PBS洗滌后，加入培養(yǎng)液吹打制成待測細胞懸液,。

2) 蓋好蓋玻片,，取一套血球計數(shù)槽，制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸適量細胞懸液到離心管中,，加入等體積臺盼藍染液,，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。若僅是單純的進行細胞計數(shù),，不考慮細胞的活力,，則可不使用臺盼藍染色。

3) 將細胞懸液滴入計數(shù)板,，注意蓋玻片下不要有氣泡,，也不要懸液流入旁邊槽中。

4) 統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù),，將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后,，數(shù)出四角的大格（每格含有16個中格）中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目,。

5) 計算原細胞懸液的細胞數(shù)。按照下面公式計算細胞密度：

6) （細胞懸液的細胞數(shù)）/ml = (四個大格子細胞數(shù)/4）×2×10⁴

3. Dual-Luciferase® Reporter Assay試劑盒檢測步驟

1) 細胞轉(zhuǎn)染：按照上述實驗分組的情況,，采用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒的方法進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,，轉(zhuǎn)染12小時后更換新鮮培養(yǎng)基；

2) 樣品裂解：轉(zhuǎn)染72小時后PBS清洗細胞兩次,，每孔加入250ul 1×PLB裂解液,，搖床上裂解細胞；

3) 樣品檢測：在96孔黑色板中加入100ul的LAR II試劑,，后加入20ul的裂解液后檢測讀數(shù),；

4) 內(nèi)參檢測：10s內(nèi)加入100ul的S & Glo底物，檢測讀數(shù),；

5) 結(jié)果分析：導出數(shù)據(jù)后采用GraphPad prism 5軟件進行結(jié)果分析并制圖,；