一,、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

一,、實(shí)驗(yàn)方法

1. 培養(yǎng)293T細(xì)胞,，待細(xì)胞長滿后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/ml,，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500uL,，37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞80%粘連,。

 2. 制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物

A) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋3’UTR雙熒光素酶報告基因載體,，輕輕混勻；

B) 用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋RBP過表達(dá)載體,，輕輕混勻,；

C) Lipofectamine 2000使用前，輕輕混勻,，用100μl無血清培養(yǎng)基稀釋2.5μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻,，室溫孵育5min,；

D) 將A、 B,、C的液體加在一起,，輕輕混勻，室溫孵育20min,，轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成,。

3. 將24孔板中200μl 培養(yǎng)基，再分別加入300uL上述混合液,，每孔終體積為500uL,。質(zhì)粒濃度均為500ng/孔，每組設(shè)置3個復(fù)孔,。

5. 37 ℃,，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-6h后，吸掉上清液,，加入500uL的*培養(yǎng)基,，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后備用。

二,、雙熒光報告基因檢測

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

 雙熒光檢測試劑盒(promega E1910)

脫色搖床(海門市其林貝爾TS200A),，低溫冷凍離心機(jī) (Sigma 3K15)，發(fā)光檢測儀 (Molecular Devices SpectraMax®i3 ),。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

具體實(shí)驗(yàn)步驟參見試劑盒說明書

裂解細(xì)胞 ：吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后,， PBS輕柔漂洗兩次，參考下表加入適量的1×PLB裂解液(用去離子水將5×Passive Lysis Buffer母液稀釋成1×PLB,，可在4℃保存1個月),，室溫?fù)u床放置15min充分裂解后備用。

注：細(xì)胞裂解后可以立即測定，也可以先凍存,，待以后再測定,。凍存樣品需融解，并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定,。

水浴溶解Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶液后,，加入到1劑量的Luciferase Assay Substrate凍干粉中，充分溶解后分裝成若干小管,，儲存在-20℃(≦1個月)或-70℃(≦1年),，使用前水浴解凍，上下顛倒兩次并恢復(fù)至室溫備用

按照每個樣本100uL用量,，取適量50×Stop & Glo®Reagent,，用Stop & Glo®Buffer稀釋成1×Stop & Glo®Reagent，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

按儀器操作說明書開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀,，將測定間隔設(shè)為2秒，測定時間設(shè)為10秒,。

每個樣品測定時,，取樣品20uL，加入100uL LARⅡ試劑,，用槍打勻后測定RLU1(relative light unit),。

加入100uL1×Stop & Glo®Reagent，用槍打勻后測定RLU2(relative light unit),。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析