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2019新型冠狀病毒是如何通過高通量基因測序在臨床樣本中被發(fā)現(xiàn)的？
2019年12月開始的新型冠狀病毒肺炎（NCP）正在國內大規(guī)模流行,，成為影響全社會的公共衛(wèi)生事件,。國內的科研機構迅速行動，在短時間內獲得了新型冠狀病毒（2019-nCoV）的全基因組序列。無論是從治療的角度還是從流行病學的角度來說,，對于疑似病例的診斷都有著極其重要的意義,。
來自武漢和廣州的研究人員報道了他們用高通量測序技術（NGS）從2名武漢大學中南醫(yī)院疑似患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中鑒定2019-nCoV的過程,，并發(fā)表在了新一期的Emerging Microbes & Infections上,。
事件還原：
2020年1月2日，從兩名患有非典型肺炎的患者中獲得了支氣管肺泡灌洗液（BALF）樣本,。
2020年1月3日,，進行SARS特異性RT PCR檢測,，產生部分RdRp片段,，并揭示了潛在的病原體,。
2020年1月4日，擴展RdRp片段并獲得更多的基因組片段,，并開始準備mNGS RNA文庫,。
2020年1月5日，完成了mNGS RNA文庫的制備,。
2020年1月6日,，開始在Miseq平臺上進行mNGS測序,。
2020年1月7日, 接收測序數據，啟動病原體鑒定流程,，獲得病毒基因組,，確定2019-nCoV為病原體，終的CoV基因組為29,881 nt,。
2020年1月8日, 進行基因組比較和進化分析,。
自2020年1月3日起，即時進展報告已發(fā)送到中國疾病預防控制中心（CDC）,，在病原體鑒定方面取得的每個進展保持同步,。
和現(xiàn)在常用的核酸檢測手段——RT-PCR相比，NGS有著不可替代的顯著優(yōu)勢,。RNA-Seq可以檢測生物體內的“感染組”,，如RNA病毒、DNA病毒,、細菌,、真核生物等，因為除朊病毒外的病原體都可以表達RNA,。RNA-Seq不僅可以檢測,，而且還能揭示病原體豐度、變異情況,、基因表達等信息,。
目前，NCP病死率比較高的患者主要分為兩類：老年人和有基礎病的患者,。有基礎病的患者感染2019-nCoV之后可能會加重基礎病,，例如繼發(fā)細菌感染，從而使病情惡化,。有些患者的免疫反應非常強,，過激的炎癥因子風暴非常危險。上一段中提到的RNA-Seq的優(yōu)勢此時就能幫助醫(yī)療人員判斷病情,，提供個性化治療,。
患者1為39歲男性，患者2為21歲女性,。2名患者入院后接受了進行了影像學檢測,，結果顯示，2名患者的肺部均可能發(fā)生了病毒感染,。隨后的常規(guī)抗病毒和抗感染治療并未緩解其癥狀,。這之后，2名患者接受了常規(guī)病原檢測,，均為陰性,。RT-PCR檢測顯示發(fā)現(xiàn)的病毒與SARS-Cov無關,。
在常規(guī)病原檢測的同時，研究者收集了2名患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）,，從中提取了總RNA,，由于總RNA濃度太低，低于Qubit核酸分析儀定量0.5ng/ul的測量下限了,，所以研究人員采用Nugen的Trio RNA-Seq微量樣本建庫試劑盒進行了文庫構建,，并在MiSeq上進行PE150測序，在24 h內各獲取了2名患者的7.34M和4.52M reads,。測序數據顯示樣本中病毒的豐度*：平均基因組覆蓋率分別為523.6X和133.7X,，估計的豐度水平分別是患者1和2測序總序列的1.5％和0.62％。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),，2名患者的幾乎全部病毒reads（分別為99.9%和99.7%）都屬于2019-nCoV,。進一步分析發(fā)現(xiàn)，雖然數據中存在單核苷酸多態(tài)性（SNP）,，但2名患者所感染的是同一冠狀病毒,，被分別命名為2019-nCoV毒株WHU01和WHU02。
研究者在建庫階段采用了Nugen公司的Trio RNA-Seq建庫試劑盒,，Trio整合了Nugen的三項技術：
- AnyDeplete技術,，能夠定向去除人體宿主rRNA,，提高信噪比,,，減少背景序列干擾。
- 單引物等溫擴增（SPIA） 技術,，可以無偏倚地從有限和降解的樣品中擴增RNA,。
- DimerFree技術，使建庫過程中不產生引物二聚體,，文庫更高效,、可靠。
在這項研究中,，相比于普通的RNA-Seq,，Trio的*優(yōu)勢極大地幫助了科研人員：
由于使用AnyDeplete技術去除了人核糖體RNA（噪音），病毒reads（信號）所占比例大大提高,，而且可以從轉錄水平上與宿主自身的RNA相比較,。2名患者的2019-nCoV reads分別占測序總數據的1.5%和0.62%，豐度非常高,，超過了表達比較高的宿主基因,，是2019-nCoV正在宿主肺部活躍復制的鐵證。
呼吸道疾病患者的BALF可能比較粘稠,，富含蛋白質,，而且來自2019-nCoV疑似病例的樣本要首先經過56°C,、30 min滅活，才能進行后續(xù)的RNA提取,。以上這些情況增加了RNA提取的難度,，會導致提取到的RNA量少、質量低,。而Trio的SPIA技術可以無偏倚地從有限和降解的樣品中擴增RNA,，保證了后續(xù)建庫的成功率和轉錄豐度的保真性。
參考文獻：
Liangjun Chen, Weiyong Liu, Qi Zhang, Ke Xu, Guangming Ye, Weichen Wu, Ziyong Sun, Fang Liu, Kailang Wu, Bo Zhong, Yi Mei, Wenxia Zhang, Yu Chen, Yirong Li, Mang Shi, Ke Lan & Yingle Liu (2020) RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak, Emerging Microbes & Infections, 9:1, 313-319, DOI: 10.1080/22221751.2020.1725399