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液體培養(yǎng)基其能有效地提高白芨種子萌發(fā)率
閱讀：78 發(fā)布時(shí)間：2025-1-14白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla Reichb.f.）多年生宿根草本植物,，根呈白色,，數(shù)個(gè)相連，故名白芨,，別名白及,、連及草、甘根,。白芨花大色艷,，具有較高的觀賞價(jià)值；同時(shí)白芨生有肥厚的肉質(zhì)塊狀假鱗莖,，是重要的中藥材之一，具有收斂止血,、消腫生肌的功效,。隨著白芨的持續(xù)開(kāi)發(fā)，市場(chǎng)需求連年增長(zhǎng),，價(jià)格逐漸上漲,，致使野生資源私挖濫采嚴(yán)重，導(dǎo)致白芨野生資源瀕臨枯竭,，現(xiàn)有的白芨資源受到嚴(yán)重破壞,，已無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，因而也被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)野生藥用植物之一,。
在自然野生狀態(tài)下,，成熟的白芨種子呈粉末狀，非常細(xì)小,，開(kāi)花授粉15周后的種子有胚率僅為59%左右,，很少萌發(fā)成苗，因此其種子自然萌發(fā)率極低,，繁殖困難,。目前人工繁育多采用分株繁殖，即將塊莖切成小塊種植,，但繁殖系數(shù)低,、消耗量大、大面積供種依然較為困難,，難以滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)的需求,。采取植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的白芨實(shí)生苗，是一種快速有效的繁殖方法,，目前主要通過(guò)將種子撒播在添加激素的固體培養(yǎng)基上萌發(fā),，再生出無(wú)菌苗，或誘導(dǎo)原球莖,、經(jīng)增殖生根后進(jìn)行快繁,，這要涉及4～5種以上的培養(yǎng)基，操作較為繁瑣,，且周期較長(zhǎng),，最短在110 d內(nèi)方能成苗移栽，相對(duì)生產(chǎn)成本較高,。為此課題組探討了一種基于液體培養(yǎng)基的白芨種苗離體快繁技術(shù),，
該技術(shù)選用液體培養(yǎng)基，用液體懸浮培養(yǎng)萌發(fā)種子,，而不是常用的固體培養(yǎng)基表面萌發(fā),，其能有效地提高白芨種子萌發(fā)率，縮短白芨成苗時(shí)間,，快速獲得白芨幼苗,，下面將該技術(shù)介紹如下。
1 未成熟白芨種子離體培養(yǎng)
1.1 種子表面滅菌及萌發(fā)
選取開(kāi)花授粉15周后,、未開(kāi)裂的白芨蒴果（含種子）,，在成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院園林園藝分院實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，去離子水沖洗1～2次,。用解剖刀及鑷子仔細(xì)剝開(kāi)果實(shí),，將種子小心地抖落到無(wú)菌組織培養(yǎng)瓶中，加適量5%的次氯酸鈉溶液（滴加1～2滴吐溫-20）消毒20 min,。用滅菌的50目細(xì)胞篩過(guò)濾種子,；再用去離子水沖洗、過(guò)濾,，反復(fù)4～6次,，沖去表面殘留的消毒液。將細(xì)胞篩上過(guò)濾的種子以MS+1.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖,、pH 5.8的種子萌發(fā)液體培養(yǎng)基沖洗到三角瓶?jī)?nèi),，于25 ℃、100 r/min黑暗培養(yǎng)15-20 d,。通常培養(yǎng)5 d后,，種子即可萌發(fā)，此時(shí)轉(zhuǎn)入16 h/8 h的光周期環(huán)境下光照培養(yǎng),，一般接種15 d后種子發(fā)育形成葉片,。
1.2 種子生長(zhǎng)成芽
將接種15 d,、已萌發(fā)的白芨種子經(jīng)50目細(xì)胞篩濾去液體，把種子原球莖接種于MS+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂,、pH 5.8的固體誘導(dǎo)成芽培養(yǎng)基上,，盡量分散幼苗，每皿約100粒,，于25 ℃,、16 h/8 h光周期培養(yǎng)。一般培養(yǎng)30 d后,，當(dāng)幼芽生長(zhǎng)為幼苗,，約2 cm左右、根長(zhǎng)約0.5 cm左右時(shí)即可進(jìn)行生根培養(yǎng),。
1.3 生根培養(yǎng)
將平皿中的白芨幼苗接種到1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+6 g/L瓊脂,、pH 5.8的固體生根培養(yǎng)基上，每瓶接種25～30株,，于25 ℃,、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗和根的生長(zhǎng),，提高壯苗生根率,。生根培養(yǎng)30 d后，組培苗生長(zhǎng)為健壯的成苗,，形態(tài)見(jiàn)圖1。
1.4 煉苗移栽
當(dāng)白芨幼苗的根生長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)（一般在白芨種子萌發(fā)后75-90 d）即可煉苗移栽,，栽前先逐漸揭開(kāi)瓶蓋適應(yīng)3-5 d外界環(huán)境,，期間注意保持瓶?jī)?nèi)濕度。移栽時(shí)用清水洗凈根部瓊脂,，避免損傷根及原球莖,；將健壯的白芨組培苗移栽到裝好育苗基質(zhì)的穴盤(pán)中，選蔬菜或花卉育苗基質(zhì)即可,，栽后基質(zhì)澆透水,，于煉苗棚中培養(yǎng)。棚中前期注意弱光保濕,，第一周應(yīng)覆蓋遮陽(yáng)網(wǎng)保持弱光,，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即生長(zhǎng)正常,，移栽30 d左右即可定植,，定植后常規(guī)田間管理，移栽情況見(jiàn)圖2,。白芨移栽存活的關(guān)鍵是原球莖的大小及活力,，一般有原球莖的幼苗均能移栽存活，存活率可達(dá)95%以上。
2 近成熟白芨種子離體培養(yǎng)
2.1 種子表面滅菌及萌發(fā)
將開(kāi)花后20周以上,、近成熟的白芨蒴果（未開(kāi)裂,，含種子）用紗布包好，自來(lái)水流水沖洗30 min,，再在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s,，無(wú)菌水沖洗1～2次，用解剖刀及鑷子小心剝開(kāi)果實(shí),，將種子小心撥入無(wú)菌組培瓶中,，加適量5%次氯酸鈉溶液（滴加2～3滴吐溫-20）消毒20 min。用滅菌的細(xì)胞篩（50目）過(guò)濾種子,；再用去離子水沖洗,、過(guò)濾，反復(fù)4～6次,，沖去表面殘留的消毒液,。將細(xì)胞篩（50目）上過(guò)濾的種子，用MS+2.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖,、pH 5.8的種子萌發(fā)液體培養(yǎng)基沖洗到三角瓶?jī)?nèi),。25 ℃、100 r/min,、黑暗培養(yǎng)15 d,。
2.2 種子生長(zhǎng)成芽
已萌發(fā)的種子經(jīng)細(xì)胞篩（50目）濾去液體，將種子原球莖接種于MS+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂,、pH 5.8的誘導(dǎo)成芽固體培養(yǎng)基上,，盡量分散種子，每皿100粒,。25 ℃,、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)20-30 d。
2.3 生根培養(yǎng)
將生成的幼苗及增殖的幼苗接種到1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+6 g/L瓊脂,、pH 5.8的生根培養(yǎng)基里,，每瓶25～30株，25 ℃,、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)30-40 d,。
2.4 煉苗移栽
當(dāng)白芨幼苗的根生長(zhǎng)到3～5 cm長(zhǎng)時(shí)，即可煉苗移栽,，栽前先揭開(kāi)瓶蓋適應(yīng)外界環(huán)境3-5 d,。移栽時(shí)先用清水洗凈根部瓊脂，注意不要損傷根及原球莖結(jié)構(gòu),；將健壯的白芨組培苗移栽到裝有育苗基質(zhì)的穴盤(pán)中,，栽后澆透水,，于煉苗棚中繼續(xù)培養(yǎng)。管理上前期注意弱光保濕,，第一周應(yīng)加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)保持弱光,，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即可生長(zhǎng)正常,，移栽30 d左右即可定植,；定植后常規(guī)田間管理。
3 成熟白芨種子離體培養(yǎng)
3.1 種子表面滅菌及萌發(fā)
將成熟的白芨蒴果（未開(kāi)裂,，含種子）用紗布包好,，自來(lái)水流水沖洗30 min；在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s,，無(wú)菌水沖洗1～2次,，用解剖刀及鑷子小心剝開(kāi)果實(shí)，將種子小心撥入無(wú)菌組培瓶中,，加適量5%次氯酸鈉溶液（滴加2～3滴吐溫-20）消毒20 min,。將細(xì)胞篩（50目）上過(guò)濾的種子用MS+0.5 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的種子萌發(fā)液體培養(yǎng)基沖洗到三角瓶?jī)?nèi),。25 ℃,、100 r/min黑暗培養(yǎng)15 d，萌發(fā)率達(dá)99%,。
3.2 種子生長(zhǎng)成芽
已萌發(fā)的種子經(jīng)細(xì)胞篩（50目）濾去液體,，將種子原球莖接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂、pH 5.8的誘導(dǎo)成芽固體培養(yǎng)基上,，每皿100粒,。25 ℃、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)20-30 d,。
3.3 生根培養(yǎng)
將長(zhǎng)大的幼苗及增殖的幼苗接種到1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭+6 g/L瓊脂、pH 5.8的生根培養(yǎng)基上,，每瓶25～30株,，25 ℃、16 h/8 h光周期環(huán)境里培養(yǎng)30-40 d,。
3.4 煉苗移栽
當(dāng)培養(yǎng)出的白芨幼苗根生長(zhǎng)到3～5 cm長(zhǎng)時(shí),，煉苗移栽，栽前先揭開(kāi)瓶蓋適應(yīng)自然條件3-5 d,。移栽先時(shí)用自來(lái)水洗凈根部附著的瓊脂,，小心不要損傷根及原球莖結(jié)構(gòu)；將健壯的白芨組培苗移栽到裝有基質(zhì)的育苗穴盤(pán)中,，栽后澆透水,，于煉苗棚中放置整齊,，繼續(xù)煉苗培養(yǎng)。管理上前期注意弱光保濕,，第一周應(yīng)加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)保持弱光,，并覆蓋薄膜保濕；移栽15 d后白芨成苗即可生長(zhǎng)正常,，移栽30 d左右即可定植,；定植后常規(guī)田間管理。
4 小結(jié)
采用近成熟的白芨種子進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng),，能顯著提高種子萌發(fā)率,，可達(dá)99%，并加快原球莖的生成速度（15 d左右）,。且該技術(shù)操作簡(jiǎn)便,，成本低廉，每瓶液體培養(yǎng)基可萌發(fā)數(shù)萬(wàn)粒種子,，且種子萌發(fā)整齊,，出苗一致，污染率低,，結(jié)合簡(jiǎn)化的固體培養(yǎng)基培養(yǎng),，大大縮短了白芨組織培養(yǎng)周期，最快能在75～90 d內(nèi)獲得大量健壯的無(wú)菌苗用于移栽,，實(shí)現(xiàn)了白芨組培苗的高效快速生產(chǎn),，并有效簡(jiǎn)化了操作程序，降低了生產(chǎn)成本,，便于規(guī)模化生產(chǎn),。