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微生物菌種怎么保存,？長期保存菌種的方法
閱讀：75 發(fā)布時間：2025-1-6微生物常識和菌種保存方法
1、常用培養(yǎng)基的制備,、滅菌與消毒
營養(yǎng)：從外部環(huán)境攝取其生命活動所必需的能量和物質(zhì),，滿足生長和繁殖需要的一種生理過程。是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動的起點,。
營養(yǎng)物：具有營養(yǎng)功能的物質(zhì)。也包括光能,。提供生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì),、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境,。
營養(yǎng)要素：碳源,、氮源、能源,、生長因子,、無機(jī)鹽和水
培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料,。要求：應(yīng)具備6大營養(yǎng)要素,；物質(zhì)比例合適,；必須滅菌。
2,、選用和設(shè)計培養(yǎng)基的原則、方法及制備過程
原則：目的明確 ,、營養(yǎng)協(xié)調(diào)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約
物理化學(xué)條件適宜
方法：生態(tài)模擬,、查閱文獻(xiàn)
精心設(shè)計,、試驗比較
步驟：稱量、熔化,、調(diào)PH,、過濾、分裝,、
加塞,、包扎、滅菌,、冷卻,、無菌檢查
培養(yǎng)基種類：
一、按成分的不同分
天然培養(yǎng)基,、合成培養(yǎng)基,、半合成培養(yǎng)基
二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分
固體培養(yǎng)基,、液體培養(yǎng)基,、半固體培養(yǎng)基
三、按培養(yǎng)基用途
基礎(chǔ)培養(yǎng)基,、選擇培養(yǎng)基 ,、加富培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基
消毒與滅菌 ：
消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體
滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子,。
方法：
一,、物理的方法：加熱、過濾,、輻射
二,、化學(xué)的方法：用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細(xì)菌代謝機(jī)能,。如重金屬離子,，磺胺類藥物及抗生素等。
加熱法：
（1）干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌,。
1,、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等,，試管口和瓶口,，涂布用玻璃棒。
2,、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160－170C）加熱滅菌1－2h,，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性,，與水的含量有關(guān),，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快,。
3,、注意事項：
1）培養(yǎng)基、橡膠制品,、塑料制品不能用此法,；
2）溫度控制在<180°；
3）物品不能太擠,；
4）溫度降至70°時才開箱門,。
（2）濕熱法 ：原理：因為濕熱中菌體吸水,，蛋白質(zhì)容易凝固,，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低,；濕熱的蒸氣有潛熱存在,。所以效果比同溫度下干熱好。
高壓蒸汽滅菌法：
1,、設(shè)備：高壓滅菌鍋
2,、時間長短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。
3,、適用于培養(yǎng)基、工作服,、橡膠物品等的滅菌,，也可用于玻璃器皿的滅菌。
4,、注意事項：
1）冷空氣*排除,；2）加水；3）壓力降為“0"時方可打開。
常壓蒸汽滅菌：對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基,、牛乳培養(yǎng)基,，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。*滅菌則采用間歇滅菌方法,。
煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿,，時間10－15min，
超高溫殺菌:135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品,。優(yōu)點 ：保持食品價值和營養(yǎng)成分,。
過濾除菌：
原理：介質(zhì)在有壓力時阻隔微生物。
適用范圍：許多材料如血清,、抗生素及糖溶液采用此法,。
設(shè)備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器,。
優(yōu)缺點：不破壞培養(yǎng)基成分,，只適用少量濾液。需 大量無菌空氣以及凈化工作臺,。
注意事項：1,、壓力適當(dāng)；
2,、無菌條件下進(jìn)行,；
3、防止?jié)B透現(xiàn)象,。
輻射滅菌：
原理：紫外線波長在200－300nm,，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強(qiáng),。此段波長易被細(xì)胞中核酸吸收,；可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時間的乘積成正比,。
缺點：穿透力不大,。距照射物<1.2m為宜。
應(yīng)用：無菌室,，醫(yī)院,。
注意事項：對眼睛和皮膚有刺激作用。
射線滅菌：r射線,，穿透力強(qiáng),，適用于堆積物品的滅菌。
化學(xué)藥品滅菌：
原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能,。
殺菌劑如重金屬離子,；
抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素,。
注意：與藥品的濃度高低，時間長短,，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān),。
常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸,、石碳酸
福爾馬林,、、高錳酸鉀,、新潔爾滅等
3,、微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)
分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程,。
為什么要進(jìn)行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌,。
常用的分離、純化方法：
單細(xì)胞挑取法 稀釋涂布平板法
稀釋混合平板法 平板劃線法
稀釋涂布平板法 ：
步驟：
1,、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏I號培養(yǎng)基,，查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60℃時,，混勻后倒平板,，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿，高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。
2,、制備污水稀釋液：10g土樣,，加入90ml無菌水中,，在三角瓶中振搖20min,。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推,，制成不同稀釋度,。
3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度,，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度,，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上,，用玻棒涂布,。
4、培養(yǎng)：高氏I號和查氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days,，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2days,。
5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面,，檢查是否一致,，保存。
平板劃線法：
1,、倒平板,，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號和實驗日期,。
2,、劃線方法
稀釋混合平板法 ：
1、先加菌
2,、倒平板時注意培養(yǎng)基溫度
3,、混合均勻
4、微生物培養(yǎng)技術(shù)
1,、斜面接種
2,、液體培養(yǎng)基接種
3、穿刺接種
4,、將已接種的斜面,、半固體和液體培養(yǎng) 基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
5、將生長好的菌種用牛皮紙包好,，置4℃冰箱中保存,。
幾種常用的保藏方法：
1、傳代培養(yǎng)法
保藏的菌種通過斜面,、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后,，置4C?冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng),、再存放,。
可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進(jìn)一步延長保存期。
2,、載體法
使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥,。
常用的載體有土壤、砂土,、硅膠,、明膠、麩皮,、磁珠和濾紙片等,。
3、懸液法
將細(xì)菌,、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存,。
溶液包括蒸餾水、糖溶液,、磷酸緩沖液,、食鹽水等,。
4、冷凍法
使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法,。包括低溫法和液氮法,。
此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護(hù)劑的使用,。
5,、真空干燥法
這類方法包括冷凍真空干燥法和L－干燥法。
冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍,，然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥,。
L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在10－20C?范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥,。
操作方法
1,、斜面保藏法
將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后,，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好）,，置4C?冰箱中包藏。
保藏時間依微生物的種類而定,。霉菌,、放線菌及芽孢菌保存2－4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月,，普通細(xì)菌一個月,，假單胞菌兩周傳代一次。
此法優(yōu)點是操作簡單,、使用方便,，缺點是保藏時間短、易被污染,。
2,、液體石蠟保藏法
將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn),，使菌種與空氣隔絕,。
將試管直立，置低溫或室溫下保存,。
此法實用且效果較好,。霉菌、放線菌,、芽孢菌可保藏兩年以上,，酵母菌可保藏1－2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右,。
3,、穿刺保藏法
按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種,，菌種長好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放,。
4,、砂土管保藏法
(1)河砂處理
取河砂若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì),。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性,，最后一次用蒸鎦水沖洗,，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒,，備用,。
(2)土壤處理
取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次,，直至中性,。烘干后碾碎，用100目篩子過篩,，粗顆粒部分丟掉,。
(3)砂土混合
處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后,，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中,，每管分裝1g左右，塞上棉塞,，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次),，最后烘干。
(4)無菌檢查
每10支砂土管隨機(jī)抽1支,，將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中,，30℃培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長,，所有砂土管則需重新滅菌,，再作無菌試驗，直至證明無菌后方可使用,。
(5)菌懸液的制備
取生長健壯的新鮮斜面菌種,，加入2-3ml無菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下,，制成菌懸液,。
(6)分裝樣品
每支砂土管(注明標(biāo)記后)加入0．5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)， 用接種針拌勻,。
(7)干燥
將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi),，干燥器底部盛有干燥劑,。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。
(8)保存
置4℃冰箱或室溫干燥處,，每隔一定的時間進(jìn)行檢測,。此法多用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌,。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛,、效果較好，可保存幾年時間,，但對營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳,。
5、冷凍真空干燥法
?。?）凍干管的準(zhǔn)備：中性硬制玻璃,，烘干，滅菌,。
?。?）菌種培養(yǎng)：細(xì)菌芽孢脫落；放,，霉孢子豐滿,。
（3）保護(hù)劑的配制：配制,，滅菌,，檢查。
?。?）菌懸液的制備：2-3ml保護(hù)劑,。
（5）分裝樣品：菌懸液每管0.2ml,。
?。?）預(yù)凍：程序控溫儀降溫。
?。?）冷凍真空干燥：-50℃下抽真空,。
（8）取出樣品：輕敲松散即達(dá)標(biāo),。
?。?）第二次干燥。
?。?0）熔封,。
（11）存活性檢測：抽取一管進(jìn)行存活性檢查。
?。?2）保存：4℃保存,。