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在迷迭香植物中提取熊果酸對照品的工藝方法
閱讀：550 發(fā)布時間：2022-5-11 迷迭香中的化學(xué)成分十分的復(fù)雜,，目前研究比較多的抗氧化成分主要為迷迭香酚,、表迷迭香酚、異迷迭香酚,、迷迭香酸及黃酮等成分。熊果酸(Ursolic acid,UA)具有抗腫瘤,、抗肝炎,、降血脂、抗動脈粥樣硬化,、抗糖尿病,、抗HIV、抗寄生蟲等作用,，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,，尚無合成品,，主要靠從植物中提取獲得[5]。從迷迭香中提取熊果酸未見有關(guān)報道,。本實驗采用溶劑提取法對迷迭香中熊果酸的最佳提取工藝進(jìn)行了研究,，同時采用高效液相色譜法準(zhǔn)確對提取物中熊果酸進(jìn)行定量，為充分利用迷迭香資源提供科學(xué)依據(jù),。
需要干制迷迭香,，由中藥標(biāo)準(zhǔn)對照品研究中心提供;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品;甲醇為色譜純，水為超純水;無水乙醇,、香草醛,、高氯酸、乙酸均為分析純,，廣州化學(xué)試劑廠出品,。高效液相色譜Jasco-1586(雙泵)，UV-1570紫外檢測器;CO-1560柱箱;LEO超聲波清洗器,，大連華洋科技儀器有限公司產(chǎn)品;PPENDORF微量移液器(德國);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,，德國Heidolph LABOROTA 4000;UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津株式會社公司產(chǎn)品,。
迷迭香中熊果酸的定性—高氯酸-香草醛法 精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品4.7 mg,，置于10 ml容量瓶中，甲醇溶解,，稀釋至刻度,，作為對照品溶液。用微量移液器移取對照品溶液1.00 ml于10 ml容量瓶中,，于100℃烘箱中烘干后,，冷卻后加入0.5 ml 5%香草醛和0.8 ml高氯酸，在60℃水浴保溫10 min,，冷卻后加乙酸溶解并稀釋至刻度,，搖勻，在546 nm處測定吸光度,。
含量測定： 高效液相色譜法測定條件 色譜條件：色譜柱為Symmetryshield RP18 (3.9 mm×150 mm,5 μm);流動相為0.2%磷酸二氫鈉-甲醇(14∶86);流速為0.8 ml/min;檢測波長為210 nm;靈敏度為0.16 AFUS;柱溫為室溫(25 ℃),。供試品溶液的制備 稱取迷迭香粉末適量，按L9(34)正交實驗表所列進(jìn)行提取,，提取過程保持溶劑回流狀態(tài),，過濾或抽濾除渣，減壓回收乙醇,，得浸膏,，將浸膏依次用石油醚、氫氧化鈉水溶液,、水洗至洗出液近無色,，烘干,。再用無水乙醇加熱溶解，加活性炭回流脫色,，過濾,。用熱乙醇反復(fù)洗滌殘渣，合并濾液及洗液,，蒸去部分乙醇,，放冷，靜置,，得白色片狀結(jié)晶提取物,。精密稱取提取物100.0 mg于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度,，作為供試品溶液,。測定 吸取上述對照品溶液和供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,，在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μl進(jìn)行分析,，根據(jù)HPLC色譜圖中的峰面積，按外標(biāo)法定量,，計算出樣品中熊果酸的含量和提取率,。
單因素實驗結(jié)果分析：提取溶劑的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，分別用甲醇,、乙醇,、醋酸乙酯、丙酮作溶劑,，以1∶25的料液比,，在60℃水浴中提取2 h，按“2.1"項進(jìn)行測定,。結(jié)果見表1,。由表1可以看出最佳的提取溶劑是乙醇。雖然丙酮的吸光度較大,，但因為丙酮有毒,，生產(chǎn)工藝要求較高，所以不選擇丙酮作提取溶劑,。表1 不同提取溶劑對提取效果的影響,。②乙醇濃度的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，分別用30%,、40%、50%,、60%,、70%,、80%、90%乙醇50 ml,，在60℃水浴中提取2 h,，按“2.1"項進(jìn)行測定。結(jié)果見表2,。從表2可以看出隨著乙醇濃度的增加,，提取物的吸光度逐漸升高，說明提取出來的熊果酸在增加,。其可能原因是隨著乙醇濃度的增大,，乙醇溶液的極性也逐步減弱，而熊果酸又屬于五環(huán)三萜類非極性物質(zhì),，根據(jù)相似相溶原理,，熊果酸易溶于純的乙醇溶液中。為了回收溶劑方便,，選擇乙醇的最佳提取濃度為90%,。③料液比的選擇稱取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇分別配制1∶10,，1∶15,，1∶20，1∶25料液比(g/ml),，在60℃水浴中提取2 h,，按“2.1"項進(jìn)行測定。結(jié)果見表3,。表2 乙醇濃度對提取效果的影響表3 物料比對提取效果的影響從表3可見,，隨著溶劑量的增加，提取物的吸光度逐漸升高,，到20倍量以后基本持平,。由于料液比增加，會給后處理工序增加困難,，而且增加生產(chǎn)成本,，在保證提取效果的同時，應(yīng)盡量減少溶劑用量和降低蒸發(fā)濃縮負(fù)荷,，因此選擇最佳料液比為1∶20,。④提取時間的選擇 稱取迷迭香粉2.0 g，用90%乙醇溶液,，以1∶20的料液比,，在60℃水浴中提取1，2，3,，4,，8 h，按“2.1"項進(jìn)行測定,。結(jié)果見表4,。表4 提取時間對提取效果的影響⑤ 提取溫度的選擇 稱取迷迭香2 g，用90%乙醇溶液為溶劑,，以1∶20的料液比,，在55，60,，65,，70，75,，80,，90℃水浴中提取4 h，按“2.1"項進(jìn)行測定,。
隨著溫度的升高,，溶劑的粘度減小，分子運動速度加快,，浸提液的擴(kuò)散系數(shù)增加,，促使浸提速度加快。從表5可以看出,，隨著溫度的提高提取物的吸光度也平緩增加,，到90℃吸光度下降，可能是因為乙醇在80℃左右沸騰,，在接近沸點時提取溫度太高,，雜質(zhì)的溶出量增加而受到影響。所以最佳的提取溫度為80℃,。
正交實驗結(jié)果分析以不同提取工藝條件下迷迭香中熊果酸的含量為指標(biāo),，以單因素各影響因子為研究對象，進(jìn)行L9(34)正交實驗,。結(jié)果見表6,。表6的結(jié)果說明，各因素對迷迭香酸提取效果的影響程度依次為B>A>D>C,，因素C,、D無顯著性差異，這說明提取溫度和提取時間在正交設(shè)計的4水平內(nèi)對迷迭香酸的含量無顯著性影響,，而提取時間太長會延長操作周期,，對生產(chǎn)不利,。因素A、B有顯著性差異,，說明料液比和乙醇濃度對迷迭香酸的含量有很大的影響,，綜合各因素的k值和直接比較，A3B3C2D1為最佳提取條件,。即料液比1∶20，溶劑比為90%的乙醇溶液,，提取溫度80℃,，提取時間3h。表6 正交實驗結(jié)果
提取次數(shù)的選擇通過正交實驗得到一個最佳提取工藝條件的組合,，按此組合,，分別提取1，2,，3,，4次，以迷迭香酸的提取率為檢測指標(biāo),，考察提取次數(shù)對提取工藝的影響,，每個實驗重復(fù)做3次，結(jié)果見表7,。從表7可以看出,，2次提取就可將大部分迷迭香酸提出，提取率達(dá)92.38%,，再增加提取次數(shù),，提取率提高不明顯。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,，本實驗采用2次提取,。表7 浸提次數(shù)對提取率的影響結(jié)合單因素和正交實驗的結(jié)果，得出迷迭香中熊果酸酸的最佳提取工藝是：料液比1∶20,，溶劑比為90%的乙醇溶液,，提取溫度80℃，提取時間3 h,，浸提兩次,。在最佳條件下熊果酸的提取率為92.38%。相關(guān)文章：熊果酸中藥標(biāo)準(zhǔn)品在植物中提取工藝的方法