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了解培養(yǎng)基配制過程各環(huán)節(jié)的要求和注意事項(xiàng)
閱讀：8465 發(fā)布時間：2021-9-23 一、目的要求
了解培養(yǎng)基的配制原理。
了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序,。
二,、基本原理
正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)，由于微生物種類及代謝類型的多樣性,，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多,，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同,，例如器皿的準(zhǔn)備,，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作,，培養(yǎng)基的滅菌,，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相向。
三,、實(shí)驗(yàn)材科
(一)藥品
待配各種培養(yǎng)的組成成分,，瓊脂，1mol/L NaOH溶液,，1mol/l (升,，統(tǒng)一用大寫)HCl溶液。
(二)儀器
天平或臺秤,，高壓蒸汽滅菌鍋,。
(三)玻璃器皿
移液管,、試管,、燒杯、量筒,、錐形瓶,、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等,。
(四)其他物品
藥匙,、稱量紙、pH試紙,、記號筆,、棉花、紗布,、線繩,、塑料試管蓋、牛皮紙,、報(bào)紙等,。
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
(一)玻璃器皿的洗滌和包裝
1．玻璃器皿的洗滌
玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將錐形瓶,、試管,、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中,，用毛刷刷洗,，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡,。再用自來水及蒸餾水沖洗,，洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。
2．滅菌前玻璃器皿的包裝
(1)培養(yǎng)皿的包裝 培養(yǎng)皿由一蓋—底組成一套,?？捎脠?bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi),，加蓋滅菌,。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。
(2)移液管的包裝 在移液管的上端塞入—小段棉花(勿用脫脂棉),。它的作用是避免外界及口中雜菌吹入管內(nèi),，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左有,。棉花自身長度約1-1．5cm,。塞棉花時，可用一外圈拉直的曲別針,，將少許棉花塞入管口內(nèi),。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn),。
先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長紙條,，然后將已塞好棉花的移液管放在長條報(bào)紙的一端，約成45度角,，折疊紙條包住,，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊,，在桌面上向前搓轉(zhuǎn),，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條,，折疊打結(jié),，準(zhǔn)備滅菌(見圖5—1—1)。
(二)液體及固體培養(yǎng)基的配制過程
1．液體培養(yǎng)基配制
(1)稱量一般可用1/100粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品,。先按培養(yǎng)基配方計(jì)算各成分的用量,，然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量,。
(2)溶化 將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來水或蒸餾水),，用玻棒攪動,，加熱溶解。
(3)定容 待全部藥品溶解后,，倒入一量筒中,，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時,，可預(yù)先配成較濃溶液,，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中,。
(4)調(diào)pH 一般用pH試紙測定培養(yǎng)基的pH,。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙,，在培養(yǎng)基中蘸一下,，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時,，可用1mol/l NaOH或1mol/l HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié),。調(diào)節(jié)pH時，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCl溶液,，防止局部過酸或過堿,，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌,，并不時用pH試紙測試,，直至達(dá)到所需pH為止。
(5)過濾 用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基,。一般無特殊要求時,，此步可省去。
2．固體培養(yǎng)基的配制
配制固體培養(yǎng)基時,，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1．5％-2％)加入,，并用玻棒不斷攪拌,，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化,，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分,。
(三) 培養(yǎng)基的分裝
根據(jù)不同需要，可將己配好培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶內(nèi),，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口,，造成污染,。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時,，可用鑷子夾一小塊脫脂棉,，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去,。
1．試管的分裝
取一個玻璃漏斗,，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管,，橡皮管下端再與另一玻璃管相接,，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時,，用左手拿住空試管中部,，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾,，中指及無名指夾住玻璃管嘴,，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)(圖5—1—2)。
裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定,，若所用試管大小為15×150 mm時,，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左右為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時,，在瓊脂*融化后,，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4m1),；半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜,。
2．錐形瓶的分裝
用于振蕩培養(yǎng)微生物用時，可在250 m1錐形瓶中加入50 ml的液體培養(yǎng)基,，若用于制作平板培養(yǎng)基用時,，可在250 m1錐形瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計(jì)算),，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化,。
(四)棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎
為了培養(yǎng)好氣性微生物,，需提供優(yōu)良通氣條件,，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或錐形瓶內(nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌,。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等,。
1．試管棉塞的制作
制棉塞時，應(yīng)選用大小,、厚薄適中的普通棉花一塊,，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔上,，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口,。也可借用玻璃棒塞入,，也可用折疊卷塞法制作棉塞(圖5—1—3)。
制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁,，不留縫隙,，以防外界微生物沿縫隙侵入。棉塞不宜過緊或過松,，塞好后以手提棉塞,，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2／3在試管內(nèi),，1／3在試管外(圖5—1—4),。
目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞。直接蓋在試管口上,。滅菌待用,。
將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管擁成一捆，外面包上一層牛皮紙,。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期,，滅菌待用。
2．錐形瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一層紗布,，再塞在瓶口上,。有時為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上,。目前也有采用無菌培養(yǎng)容器封口膜直接蓋在瓶口,，既保證良好通氣，過濾除菌又操作簡便,，故極受歡迎,。
在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上八層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好,，滅菌待用,。
(五)培養(yǎng)基的滅菌
培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎之后，應(yīng)立即進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,，100Pa滅菌20min（滅菌條件根據(jù)培養(yǎng)基不同有所差異,，含糖培養(yǎng)基105℃，30min）,。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)暫存于冰箱中,。
(六)斜面和平板的制作
1．斜面的制作
將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管,，趁熱置于木棒上,，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面(圖5—1—5),。斜面長度不超過試管長度1／2為宜,。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝,。
2．平板的制作
將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后,，待冷至50℃左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時,，皿蓋上的冷凝水太多,，溫度低于50℃，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板,。
平板的制作應(yīng)采用無菌操作,，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶的底部或試管,，左于同時用小指和手掌將棉塞打開,，灼燒瓶口，月左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫,，至瓶口正好伸入,，傾入10-12m1的培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋,，置于桌上,，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿、使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中,、冷凝后即成平板(圖5—1—6),。
(七)培養(yǎng)基的無菌檢查
滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無菌檢查,。最好從中取出1-2管（瓶）,，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1—2天，確定無菌后方可使用,。
(八)無菌水的制備
在每個250 mL的錐形瓶內(nèi)裝99mL的蒸餾水并塞上棉塞,。在每支試管內(nèi)裝4.5m1蒸餾水。塞上棉塞或蓋上塑料試管蓋,。再在棉塞上包上一張牛皮紙,。高壓蒸汽滅菌，100 Pa滅菌20分鐘,。