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高效液相色譜儀原理對樣品的進樣方式要求
閱讀：2369 發(fā)布時間：2021-9-13 高效液相色譜儀主要的組成部件為高壓輸液泵、進樣裝置,、色譜柱,、檢測器和色譜數(shù)據(jù)處理裝置。
1.高壓輸液泵
由于高效液相色譜所使用的色譜柱一般裝填小于10μm的固定相顆粒,，故對流動相有較大的阻力,，所以對于泵的耐壓有一定的要求。除此之外,，對于輸液泵還有泵體材料耐化學(xué)腐蝕,、輸出流量范圍寬、輸出流量穩(wěn)定等要求,。
高壓輸液泵可以分為恒壓泵和恒流泵兩大類,。
恒壓泵是指輸出恒定壓力的泵，當(dāng)系統(tǒng)阻力不變時可以保持恒定流量,，但系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時,，就會影響到系統(tǒng)流量穩(wěn)定，因此現(xiàn)在基本已不使用,。恒流泵是指可輸出恒定體積流量的泵,，又分為注射型泵和往復(fù)式柱塞泵兩類。注射型泵由于其工作過程中需停流吸液以及價格昂貴等原因，目前基本不用于高效液相色譜儀中,。往復(fù)式柱塞泵則可以提供低脈動的連續(xù)穩(wěn)定液流,，廣泛應(yīng)用于各種商品化儀器中，并衍生出了雙柱塞往復(fù)式并聯(lián)泵,、雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵,、雙柱塞獨立驅(qū)動的往復(fù)式串聯(lián)泵等多種設(shè)計。
2.進樣裝置
在HPLC分析中由于使用了高效顆粒填料和高壓的流動相,，因而對樣品的進樣方式要求提高,，需要使樣品在進入色譜柱頭時準確地注人其上端填料的中心，形成集中的一點,，以保證擴散效應(yīng)影響降到,。為實現(xiàn)以上要求有兩種設(shè)計：停流進樣和六通閥進樣，但現(xiàn)在停流進樣技術(shù)已經(jīng)*被簡單易用的六通閥進樣方式所取代,。
3.色譜柱
色譜柱一般使用內(nèi)壁拋光的直型不銹鋼管作為柱管以獲得高柱效,。當(dāng)使用粗內(nèi)徑短柱和細內(nèi)徑色潛柱時，需要注意柱外效應(yīng)所引起的色譜峰展寬,，應(yīng)該盡量縮短進樣器至檢測器之間的連接管路,，以獲得更小的柱外死體積,。
HPLC色譜柱裝填的固定相,，其基體材料多為全多孔球形或無定形的硅膠顆粒，在高壓下使用勻漿裝柱法裝填,，并在色譜柱兩端使用多孔不銹鋼燒結(jié)材料的過濾片以阻擋流動相中的微小機械雜質(zhì)進入,，并防止固定相流失。
4.檢測器
檢測器主要用于檢測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化,。常用的檢測器為紫外/可見光檢測器,、熒光檢測器、示差折光檢測器,、蒸發(fā)光散射檢測器等,。
5.色譜數(shù)據(jù)處理裝置
高效液相色譜的分析結(jié)果數(shù)據(jù)現(xiàn)已廣泛使用色譜數(shù)據(jù)工作站來記錄和處理。色譜工作站基于微型計算機的硬件,，可以實現(xiàn)如下功能：
(1) 儀器操作參數(shù)的控制功能——色譜儀的所有可控參數(shù),，均可預(yù)先設(shè)定并保存記錄，在運行樣品時自動調(diào)用并傳輸至儀器,。
(2) 數(shù)據(jù)采集和處理功能——可通過計算機和儀器之間的數(shù)據(jù)傳輸接口自動采集色譜數(shù)據(jù),。并根據(jù)處理參數(shù)進行數(shù)據(jù)處理，提供色譜圖的相關(guān)積分數(shù)據(jù),，還可以選擇不同的標準計算方式來對樣品自動進行計算,，得到定性或定量的結(jié)果。還具有計算柱效、繪制工作曲線等其他功能,。
(3) 計量認證功能——通過工作站完成對儀器的自動認證程序,，包括流量精度、色譜柱控溫精度,、檢測器能量檢測等多項參數(shù),，并提供詳細的計量報告。 .
(4) 多臺儀器的自動控制——可以適時控制多套HPLC,、系統(tǒng),，并同時獨立進行方法設(shè)定、樣品運行,、數(shù)據(jù)采集處理,。
高效液相色譜的原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶(極性不同,，避免固定液流失),，有一個明顯的分界面。當(dāng)試樣進入色譜柱,，溶質(zhì)在兩相間進行分配,。達到平衡時，服從于高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中,，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度,；cm--溶質(zhì)在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積,；Vm—流動相的體積,。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K,，K大的組分保留值大,；但也有不同之處，GPC中,，流動相對K影響不大,，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小于固定液的極性,。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大于固定液的極性,。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求*不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解,；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力,，會造成固定液流失。上世紀70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相(見后),，可克服上述缺點?，F(xiàn)在應(yīng)用很廣泛(70~80%),。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑(如硅膠,、氧化鋁等),。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當(dāng)試樣進入色譜柱時,，溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附(未進樣時,，所有的吸附劑活性中心吸附的是S)，可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質(zhì)分子,；Sa--固定相中的溶劑分子,；Xa--固定相中的溶質(zhì)分子；Sm--流動相中的溶劑分子,。 當(dāng)吸附競爭反應(yīng)達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數(shù),。[討論：K越大，保留值越大,。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相,。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離,。以陰離子交換劑為例,，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當(dāng)交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數(shù)為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關(guān)系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中,，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物,，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子(也可是陽離子),；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對(如氫氧化四丁基銨,、氫氧化十六烷基銨等),；X Y---形成的離子對化合物,。 當(dāng)達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據(jù)定義，分配系數(shù)為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關(guān)系] 離子對色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問題,，諸如酸,、堿和離子、非離子混合物,，特別是一些生化試樣如核酸,、核苷、生物堿以及藥物等分離,。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相,，電解質(zhì)溶液為流動相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器,，為消除流動相中強電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾,，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相,，分離陰離子(如Br-)為例,。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動相(NaOH)進入色譜柱時，發(fā)生如下交換反應(yīng)(洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過程)： 擔(dān)體圖示
抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見,，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水,，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-,，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測,。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用于陽離子分析,。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相,。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多,，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米,。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離,。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動力學(xué)體積或分子大小有關(guān),。試樣進入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過,。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻,，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn),，一些很小的分子可以進入所有膠孔并滲透到顆粒中,，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn),。