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流式細胞儀檢測細胞信號研究的幾個優(yōu)點
閱讀：834 發(fā)布時間：2021-4-14隨著收集數(shù)據(jù)的能力,，在單個細胞的水平,，流式細胞儀檢測細胞信號研究提供了幾個優(yōu)點流式細胞儀與裂解為基礎的方法，有利于異構信號反應的檢測和分析,。因此,，有可能區(qū)分一個強大的蛋白磷酸化響應于一個更小的，但更均勻的響應細胞與一小口,。此外,，特定的細胞表面標志物的復雜的細胞混合物，如全血細胞亞群內的熒光抗體,，蛋白磷酸化介導的信號反應可以檢測到,。此外，罕見的細胞群無預富集的細胞可以被發(fā)現(xiàn),。其結果是,，獲得豐富的數(shù)據(jù)，從有限的細胞樣品,。
BD的?Phosflow產(chǎn)品包括一個系統(tǒng)優(yōu)化的緩沖液和熒光單克隆抗體的流式細胞儀檢測細胞內信號分子和特定的翻譯后修飾,。通過流式細胞術檢測特定的磷酸化的抗原表位，細胞固定,，并維持的信號??蛋白的磷酸化狀態(tài),，然后透性，以允許進入細胞特異性結合靶蛋白的抗體,。流式細胞儀分析染色的細胞,，就可以捕獲細胞內信號蛋白磷酸化的一個“快照”。
蛋白磷酸化是短暫的性質,，嚴重受蛋白磷酸酶,。適當?shù)拇碳r間點都需要及時滅活磷酸磷蛋白檢測方法，包括Western blot分析,。同樣,，流式細胞儀分析細胞樣品必須被迅速固定保持phosphoepitopes,。另一個重要因素是磷蛋白的表達水平。某些蛋白質的磷酸化事件可以是困難的,，特別是當在單細胞水平檢測細胞表達一個特定的信號蛋白的水平低,，或表現(xiàn)出不完整的感興趣的部位的磷酸化。BD提供高品質的明亮的熒光抗體直接結合,，大大提高了細胞內磷酸化檢測,。
人類外周血單核細胞進行染色的Alexa Fluor?647抗人CD127的抗體在15分鐘的刺激0 - 0.01，0.1-,，1 - ，10 - ,，或100-ng/mL重組人IL-2的劑量的,。固定細胞，使用BD Cytofix固定緩沖液,，使用BD Phosflow的燙發(fā)緩沖液III透性,，并與熒光Stat5的（pY694）的特異性抗體，CD4,，CD8,，和CD25的染色。樣品采集使用BD LSRFortessa?流式細胞儀系統(tǒng),，,，并分析使用Cytobank軟件。CD4 + T細胞亞群被確定,，如圖所示,。相比其他T細胞，Stat5的磷酸化調節(jié)性T細胞在IL-2的濃度低得多,。
多參數(shù)流式細胞儀檢測細胞內信號的檢測和分析復雜混合物中的細胞內和細胞亞群的關鍵優(yōu)勢,。由于細胞信號轉導研究往往未受刺激的刺激或抑??制分子，本文由中藥標準對照品研究中心整理提供或未經(jīng)處理的細胞治療研究細胞反應往往提供的評估背景染色的控制,。與免疫球蛋白同種型對照,，未刺激的細胞控制考慮到各抗體的*的背景特征以及基底感興趣的細胞內磷酸化蛋白的表達水平。細胞通透性需要暴露磷酸化的抗原表位,。雖然多個緩沖系統(tǒng),，BD Phosflow的燙發(fā)緩沖III建議對于大多數(shù)應用程序。BD Biosciences公司的網(wǎng)站包含有用的信息,，各種BD細胞表面標記和細胞內抗體在不同的緩沖條件和染色協(xié)議的性能,。
BD Phosflow套件提供了有用的工具，用于分析的適應性和先天免疫系統(tǒng)的細胞所引起的信號反應,。這些套件包括熒光抗體雞尾酒特異的細胞表面標志確定具體的白細胞亞群以及熒光抗體主要磷酸化,。此外,，該套件提供兼容的緩沖區(qū)，陽性和陰性對照細胞,，以及詳細的協(xié)議,。人單核細胞/ NK細胞的活化試劑盒（目錄號562089）的BD Phosflow?允許同時研究從人全血中的B細胞，T細胞,，單核細胞,，NK細胞中的蛋白磷酸化，而的BD Phosflow?人T-細胞活化試劑盒（貨號：560750）是有用的CD4與CD8 + T細胞中的磷酸化反應的研究,。
人全血刺激的人IL-4和固定,，透化，染色使用BD Phosflow人類單核細胞/ NK細胞激活工具箱,。樣品采集,，并通過流式細胞儀使用的BD LSRFortessa?細胞分析儀，然后分析使用Cytobank軟件的分析,。白細胞的子集被確定,，如圖所示。STAT6的（pY641）和Stat5（pY694）磷酸化反應的的IL-4的分析結果顯示,，所有四個白細胞亞群通過磷酸化STAT6的IL-4,。相比之下，Stat5的反應差別很大之間的細胞類型,，不顯示檢測STAT5磷酸化響應與NK細胞,。