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多色流式細胞術分析細胞內(nèi)特定的細胞類型
閱讀：645 發(fā)布時間：2021-4-13 多色流式細胞術是一種強大的技術，用于分析細胞內(nèi)特定的細胞類型中表達的蛋白質(zhì),。對于許多類型的細胞,，如Th17細胞，細胞表面和細胞內(nèi)標記物的結(jié)合使用是必要的明確的表型鑒定,。表征信號響應于特定的靶細胞的性質(zhì),，可用于表面標志物的同時分析和信號轉(zhuǎn)導蛋白。
細胞表面染色的技術是比較標準的,，往往依賴于目標蛋白的生物學細胞內(nèi)標記物的染色,。根據(jù)在細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的位置，與其他分子,，它的穩(wěn)定性,，不同的細胞制備和染色方法的建議。細胞因子,，例如,，典型的分泌蛋白。但是,，如果它們在細胞內(nèi)被困住的,，它們可以被污染：BD GolgiStop的?（含莫能菌素）或BD GolgiPlug的?（含布雷菲德菌素甲）如使用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑作為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。細胞因子是相對使用的溫柔固定和通透賦予由BD Cytofix / Cytoperm?固定和透化解決方案訪問,。
相反,，細胞因子，轉(zhuǎn)錄因子通常被定位在細胞核內(nèi)DNA和其他蛋白質(zhì)結(jié)合,。一些蛋白質(zhì)的磷酸化,，如Stat5的，導致二聚體的形成,，還掩蓋了磷酸化的表位,。此外，細胞內(nèi)磷酸酶可以快速去磷酸化蛋白,。因此,，處理后的細胞,，必須迅速地固定，并進行更強的通透條件允許抗體進入細胞核并進入破壞的分子復合物的抗原表位內(nèi),。
所用的透化技術產(chǎn)生負面影響的細胞表面和其他細胞內(nèi)抗原的檢測,。允許進入細胞核，并打開DNA /蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復合物的相同的技術往往能細胞表面抗原變性,，防止其被抗體的檢測,。雖然不同的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的檢測可能需要不同的條件，基本原則是相同的：細胞是固定的,，通透的,，然后用熒光抗體染色細胞。
細胞內(nèi)染色的基本原則細胞固定和通透（象征虛線膜）,，染色,，然后用流式細胞儀分析。對于分泌的蛋白質(zhì)的研究中,，細胞首先與一種蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑治療的目標蛋白在細胞內(nèi)的積累,，以允許..
胞內(nèi)流式細胞儀BD工具為了促進BD流式細胞儀檢測細胞內(nèi)，已經(jīng)開發(fā)了幾個包,，緩沖區(qū)和協(xié)議,。此外，許多關鍵的細胞表面標志的特定熒光抗體測試幾個緩沖系統(tǒng),，以節(jié)省研究人員的時間,，樣品，和金錢,。常用的為特定的應用程序的BD緩沖器包括：
檢測細胞因子BD Cytofix / Cytoperm的固定/通透的解決方案（編號：554722）是適用于染色大多數(shù)細胞因子和細胞表面標志,。該緩沖系統(tǒng)也可用于一些轉(zhuǎn)錄因子和其它細胞內(nèi)蛋白染色。該緩沖系統(tǒng)包含溫和的洗滌劑以及與甲醛固定液,。
轉(zhuǎn)錄因子是專為BD Pharmingen公司的轉(zhuǎn)錄因子的緩沖液設置（部件號五十六萬二千七百二十五分之五十六萬二千五百七十四）單獨或結(jié)合細胞表面標志物和細胞因子的轉(zhuǎn)錄因子染色,。該緩沖系統(tǒng)包含溫和的洗滌劑以及與甲醛固定液。
檢測磷酸化蛋白的BD Phosflow?燙發(fā)緩沖III（貨號：558050）推薦的通透緩沖通過流式細胞儀phosphoepitope檢測,。彼爾姆緩沖III是一個嚴酷的以酒精為基礎的緩沖區(qū),。也可替代通透性緩沖區(qū)，以適應特定的實驗要求,。
優(yōu)化細胞通透性條件不同表位的位置的通透條件決定的抗原表位的細胞內(nèi)的無障礙,。磷酸701表位（橙色）位于的STAT蛋白二聚體，而磷酸絲氨酸727表位是位于外二聚化地區(qū),。對于的磷酸701網(wǎng)站,，如燙發(fā)緩沖III染色所需的更嚴厲的緩沖。以誘導蛋白的磷酸化,，人外周血單核細胞（PBMCs）被留下未處理的（ - ）或（+）激活的人IFN-α（急性髓pY701）或PMA（急性髓pS727）,。細胞被固定使用BD Cytofix?固定緩沖通透使用BD Phosflow?燙發(fā)緩沖區(qū)I,，II，III,，IV,，染色前用熒光磷酸化抗體。