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核酸檢測(cè)PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)要點(diǎn)有哪些,？
疫情暴發(fā)以后，國(guó)家對(duì)生物安全問題的重視程度越來越高,，目前,，生物安全已經(jīng)上升到國(guó)家高度，其已納入體系,，系統(tǒng)規(guī)劃國(guó)家生物安全風(fēng)險(xiǎn)防控和治理體系建設(shè),，全面提高國(guó)家生物安全治理能力迫在眉睫。2020年10月17日《中華人民共和國(guó)生物安全法》正式發(fā)布,，自2021年4月15日起施行,，其中對(duì)于病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全做出了詳細(xì)的規(guī)定。
醫(yī)院諸多實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)會(huì)涉及到生物安全問題,，尤其是針對(duì)病毒核酸檢測(cè)活動(dòng),，基本上為目前生物安全要求高的診斷工作。生物安全對(duì)醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的重要性可見一斑,，因此,，為進(jìn)一步加強(qiáng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室生物安全管理工作，2020年10月16日國(guó)家衛(wèi)健委開始牽頭組織修訂《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》,。
一 醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)介
醫(yī)院很多診斷基于各類實(shí)驗(yàn)進(jìn)行支持活動(dòng),，這些實(shí)驗(yàn)活動(dòng)一般在檢驗(yàn)科和病理科的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)如涉及生物安全問題,，則必須符合相應(yīng)等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn),。
WS/T 422-2014《臨床實(shí)驗(yàn)室生物安全指南》將“臨床實(shí)驗(yàn)室”定義為：對(duì)取自人體的各種標(biāo)本進(jìn)行生物學(xué)、微生物學(xué),、免疫學(xué),、化學(xué)、血液免疫學(xué),、血液學(xué),、生物物理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等檢驗(yàn),，并為臨床提供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)的實(shí)驗(yàn)室,。
GB/T 22576-2008《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的要求》將“醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室”定義為：以為診斷,、預(yù)防、治療人體疾病或評(píng)估人體健康提供信息為目的,，對(duì)來自人體的材料進(jìn)行生物學(xué),、微生物學(xué)、免疫學(xué),、化學(xué),、血液免疫學(xué)、血液學(xué),、生物物理學(xué),、細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)或其他檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室,，實(shí)驗(yàn)室可以提供其檢查范圍內(nèi)的咨詢服務(wù),，包括解釋結(jié)果和為進(jìn)一步的適當(dāng)檢查提供建議。
上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的定義對(duì)于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和臨床實(shí)驗(yàn)室基本相同,，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和臨床實(shí)驗(yàn)室為同一種實(shí)驗(yàn)室。
《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》將“病原微生物實(shí)驗(yàn)室”定義為：從事與病原微生物（能夠使人或者動(dòng)物致病的微生物）菌（毒）種,、樣本有關(guān)的研究,、教學(xué)、檢測(cè),、診斷等活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室,。
病原微生物危害程度分類：根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對(duì)個(gè)體或者群體的危害程度,，將病原微生物分為四類：
表1 病原微生物的分類
名稱
定義
一類病原微生物
是指能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物,，以及我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。
第二類病原微生物
是指能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病,，比較容易直接或者間接在人與人,、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物,。
第三類病原微生物
是指能夠引起人類或者動(dòng)物疾病,，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害,，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限,，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物,。
第四類病原微生物
是指在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物,。
注1：一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物,。
醫(yī)院從事病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)必須在符合相應(yīng)等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行,。GB50346-2011《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》將“生物安全實(shí)驗(yàn)室”定義為：通過防護(hù)屏障和管理措施,，達(dá)到生物安全要求的微生物實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。包括主實(shí)驗(yàn)室及其輔助用房,。
生物安全實(shí)驗(yàn)室根據(jù)所操作致病性生物因子的傳播途徑可分為a類和b類,。
表2 生物安全實(shí)驗(yàn)室的分類
名稱
定義
a
指操作非經(jīng)空氣傳播生物因子的實(shí)驗(yàn)室
b
指操作經(jīng)空氣傳播生物因子的實(shí)驗(yàn)室
b1
指可有效利用安全隔離裝置進(jìn)行操作的實(shí)驗(yàn)室
b2
指不能有效利用安全隔離裝置進(jìn)行操作的實(shí)驗(yàn)室
實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平分級(jí)：根據(jù)對(duì)所操作生物因子采取的防護(hù)措施，將實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平分為一級(jí),、二級(jí),、三級(jí)和四級(jí)，一級(jí)防護(hù)水平低,，四級(jí)防護(hù)水平高,，依據(jù)國(guó)家相關(guān)規(guī)定。
表3 生物安全實(shí)驗(yàn)室的分類
實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)稱
適用范圍
簡(jiǎn)稱
備注
生物安全防護(hù)水平為一級(jí)的實(shí)驗(yàn)室
適用于操作在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物,。
P1,、BSL-1實(shí)驗(yàn)室
生物安全防護(hù)水平為二級(jí)的實(shí)驗(yàn)室
適用于操作能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人,、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害,，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病,，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物,。
P2、BSL-2實(shí)驗(yàn)室
P2+,、加強(qiáng)型BSL-2實(shí)驗(yàn)室
通過機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)等措施加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求的實(shí)驗(yàn)室
生物安全防護(hù)水平為三級(jí)實(shí)驗(yàn)室
適用于操作能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病,，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人,、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物,。
P3、BSL-3實(shí)驗(yàn)室
生物安全防護(hù)水平為四級(jí)實(shí)驗(yàn)室
適用于操作能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物,，以及我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物,。
P4、BSL-4實(shí)驗(yàn)室
其中以BSL-1,、BSL-2,、BSL-3、BSL-4表示僅從事體外操作的實(shí)驗(yàn)室的相應(yīng)生物安全防護(hù)水平,。以ABSL-1（Animal Biosafety Level 1, ABSL-1）,、ABSL-2、ABSL-3,、ABSL-4表示包括從事動(dòng)物活體操作的實(shí)驗(yàn)室的相應(yīng)生物安全防護(hù)水平,。
二 肺炎核酸檢測(cè)PCR實(shí)驗(yàn)室
通常醫(yī)院檢驗(yàn)科和病理科等科室使用的實(shí)驗(yàn)室為生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室。但病毒核酸檢測(cè)用PCR實(shí)驗(yàn)室則不同,，《醫(yī)療機(jī)構(gòu)發(fā)熱門診臨床實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)專家共識(shí)（2020 版）》說明：對(duì)于用于病毒檢測(cè)的PCR實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱“PCR實(shí)驗(yàn)室”）選址宜設(shè)置在發(fā)熱門診內(nèi),，且建筑標(biāo)準(zhǔn)宜滿足加強(qiáng)型醫(yī)學(xué)BSL-2實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn),。
《醫(yī)學(xué)生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》T/CECS 662-2020則對(duì)加強(qiáng)型醫(yī)學(xué)BSL-2實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)要求進(jìn)行了規(guī)定?！夺t(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室布局和流程進(jìn)行了明確規(guī)定,。
《關(guān)于印發(fā)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)導(dǎo)則（試行）的通知》則對(duì)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)做出了整體要求。下面結(jié)合上述四部規(guī)范相關(guān)要求和實(shí)際建設(shè)的PCR實(shí)驗(yàn)室案例對(duì)建設(shè)要點(diǎn)進(jìn)行梳理,。
1 PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)合理選址和布局
《醫(yī)療機(jī)構(gòu)發(fā)熱門診臨床實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)專家共識(shí)（2020 版）》要求,，對(duì)于用于病毒檢測(cè)的PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置在檢驗(yàn)科中心實(shí)驗(yàn)室和急診實(shí)驗(yàn)室以外的區(qū)域，宜在發(fā)熱門診區(qū)域內(nèi),，同時(shí),，應(yīng)自成一區(qū)，宜設(shè)置在建筑的一端,。
實(shí)驗(yàn)室防護(hù)區(qū)應(yīng)包括主實(shí)驗(yàn)室,、緩沖間更換間等，輔助工作區(qū)應(yīng)包括清潔衣物更換間,、淋浴間等,。
PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局一般可分為 “四區(qū)”，即試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本制備區(qū),、核酸擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。結(jié)合實(shí)際,，可采用集中布置或分散布置形式，并配套設(shè)置洗消設(shè)施,。
當(dāng)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀時(shí),，核酸擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并為一區(qū)。當(dāng)采用一體化自動(dòng)化核酸分析設(shè)備時(shí),，樣本制備區(qū),、核酸擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并為一區(qū)。
《病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南（第四版）》指出,，病毒核酸檢測(cè)方法主要是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法,，所以用于病毒檢測(cè)的PCR實(shí)驗(yàn)室可以設(shè)置為 “三區(qū)”。
圖1 “三區(qū)”的PCR實(shí)驗(yàn)室
2 PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)合理規(guī)劃?rùn)z驗(yàn)人員
動(dòng)線,、標(biāo)本動(dòng)線和污物動(dòng)線
PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本制備室的生物安全要求高,，檢驗(yàn)人員進(jìn)入該區(qū)域緩沖間前需要在更衣室穿護(hù)服，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在緩沖間脫掉護(hù)服,，因此需要設(shè)置更衣室和合理規(guī)劃進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室動(dòng)線,。
為提高效率，咽拭子標(biāo)本宜設(shè)置可直接進(jìn)入標(biāo)本制備室的運(yùn)輸動(dòng)線,，同時(shí)標(biāo)本傳遞口應(yīng)設(shè)置傳遞窗,。
根據(jù)《病毒感染的肺炎疫情醫(yī)療廢物應(yīng)急處置管理與技術(shù)指南（試行）》要求,，有條件的醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)可對(duì)肺炎疫情防治過程產(chǎn)生的感染性醫(yī)療廢物的暫時(shí)貯存場(chǎng)所實(shí)行專場(chǎng)存放、專人管理,，不與其他醫(yī)療廢物和生活垃圾混放,、混裝。
因此,，針對(duì)標(biāo)本制備室高壓滅菌消毒后的污物,，應(yīng)規(guī)劃污物運(yùn)輸動(dòng)線和相對(duì)獨(dú)立的暫存間。
圖2 PCR實(shí)驗(yàn)室平面圖（布局,、分區(qū)和動(dòng)線）
3 PCR實(shí)驗(yàn)室氣流組織應(yīng)符合定向氣流原則
氣流組織應(yīng)有利于室內(nèi)氣流由被污染風(fēng)險(xiǎn)低的空間向被污染風(fēng)險(xiǎn)高的空間流動(dòng),，大限度減少室內(nèi)回流與渦流。通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)保證各工作區(qū)的空氣不產(chǎn)生交叉污染,。
實(shí)驗(yàn)室的空氣流向可按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行,，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。
圖3 PCR實(shí)驗(yàn)室平面圖（風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域劃分）
4 試劑準(zhǔn)備區(qū)為正壓
試劑準(zhǔn)備區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備,、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備,。因此，該區(qū)并不產(chǎn)生污染源,，但須確保試劑免受外界污染,，該區(qū)相對(duì)緩沖間和標(biāo)本制備室應(yīng)設(shè)置為正壓。
5 標(biāo)準(zhǔn)制備區(qū)要保持負(fù)壓
標(biāo)本制備區(qū)為實(shí)驗(yàn)室核心工作區(qū),，其主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存,、核酸(RNA、DNA)提取,、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成,。取樣時(shí)病毒還未滅活，且在取樣操作時(shí),，容易造成氣溶膠擴(kuò)散,。
《病毒肺炎防控方案（第七版）》指出，病毒的主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫和接觸傳播,，在相對(duì)封閉的環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能,。
因此，為保護(hù)人員安全,，必須在生物安全柜內(nèi)操作,，防止標(biāo)本氣溶膠的擴(kuò)散。此后,，標(biāo)本經(jīng)過滅活處理,，使病毒蛋白不再有生理活性，失去感染、致病和繁殖能力,，使操作人員在對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)相對(duì)安全,，但是病毒蛋白的基因序列并沒有受到影響。
因此,，后續(xù)操作時(shí)主要防止含有病毒核算的氣溶膠污染造成“假陽性”現(xiàn)象,。因此，該區(qū)會(huì)產(chǎn)生污染源物,，該區(qū)對(duì)緩沖間和試劑準(zhǔn)備室保持負(fù)壓,，負(fù)壓值小于擴(kuò)增分析室。
6 擴(kuò)增分析區(qū)負(fù)壓值高
擴(kuò)增分析區(qū)主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增和擴(kuò)增片段的測(cè)定,。操作過程中,，要防止含病毒核酸的氣溶膠通過開門卷吸等途徑，擴(kuò)散出去對(duì)試劑與標(biāo)本造成污染,，造成“假陽性”現(xiàn)象,。所以擴(kuò)增分析區(qū)對(duì)緩沖間和標(biāo)本制備室應(yīng)設(shè)置保持負(fù)壓，且該區(qū)為實(shí)驗(yàn)室負(fù)壓大的房間,。
7 關(guān)于通風(fēng)系統(tǒng)的設(shè)置
對(duì)于標(biāo)本制備室采用的生物安全柜宜設(shè)置ⅡA2型生物安全柜,，在生物安全柜操作面或其他有氣溶膠操作地點(diǎn)的上方附近不應(yīng)設(shè)送風(fēng)口，不宜設(shè)置可開啟門的正對(duì)面方向,。
機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)時(shí)應(yīng)避免交叉污染,，排風(fēng)機(jī)應(yīng)設(shè)置在排風(fēng)管路末端，排風(fēng)應(yīng)設(shè)置高效過濾器,，并通過獨(dú)立于建筑物其他公共通風(fēng)系統(tǒng)的管道排出,。
PCR實(shí)驗(yàn)室宜采用全新風(fēng)直流式空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)，可降低空調(diào)系統(tǒng)“藏毒”風(fēng)險(xiǎn),。各區(qū)工作間不應(yīng)設(shè)置可開啟外窗,，入口應(yīng)設(shè)置緩沖間,當(dāng)緩沖間的門設(shè)置互鎖時(shí),應(yīng)在互鎖門的附近設(shè)置緊急手動(dòng)解除互鎖開關(guān)。應(yīng)在合適位置設(shè)測(cè)壓孔,，并采用密封措施。在入口處宜安裝空氣壓力顯示裝置,，量程應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室靜壓差相匹配,。可設(shè)置自動(dòng)報(bào)警功能,。
表4 加強(qiáng)型醫(yī)學(xué)BSL-2標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)室主要技術(shù)要求和指標(biāo)
技術(shù)要求
指標(biāo)
通風(fēng)方式
機(jī)械通風(fēng),，不應(yīng)自然通風(fēng)；且不宜使用循環(huán)風(fēng)
緩沖間
應(yīng)設(shè)置
核心工作間相對(duì)于相鄰區(qū)域小負(fù)壓（Pa）
不宜小于-10Pa
高效過濾排風(fēng)
有
高效過濾送風(fēng)
宜設(shè)置
溫度（℃）
18～26
相對(duì)濕度（%）
30～70
噪聲[DB(A)]
≤60
核心工作間平均照度[lx]
≥300
PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保證用電的可靠性,，用電負(fù)荷等級(jí),、自動(dòng)恢復(fù)供電時(shí)間的確定應(yīng)符合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。離心機(jī)電源宜與重要儀器設(shè)備分開接線。重要儀器設(shè)備應(yīng)配備不間斷電源,，當(dāng)設(shè)置不間斷電源（UPS）時(shí),，工作時(shí)間不宜小于30min。標(biāo)本制備區(qū)或者消毒間內(nèi)需配備壓力蒸汽滅菌器以及其他適用的消毒設(shè)備,，用于穿過的護(hù)服和用過的咽拭子樣本瓶等污染物品消毒,，因此設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)預(yù)留大功率電源。設(shè)置紫外線消毒燈具時(shí),，燈具距地1.8～2.2m,控制開關(guān)應(yīng)設(shè)置在消毒區(qū)域之外,，控制開關(guān)的面板形式或顏色宜區(qū)別于普通照明開關(guān)，安裝高度宜距地1.8m以上,，防止誤操作,。
PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置緊急噴淋裝置和洗眼裝置。每個(gè)房間的出口處均應(yīng)設(shè)置非手動(dòng)開關(guān)的洗手池（如腳踏式或感應(yīng)式）,，給水管不應(yīng)與衛(wèi)生器具,、實(shí)驗(yàn)設(shè)備直接連接，應(yīng)設(shè)置空氣隔斷或倒流防止器,，并為后期檢修,、更換預(yù)留條件。