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祿米教您怎樣操作實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌環(huán)境怎樣監(jiān)控和檢測(cè)？
【導(dǎo)讀】 微生物檢測(cè)人員天天都需要在無(wú)菌室工作,，在超凈臺(tái)或者生物安全柜里操作,，為了保證我們檢測(cè)的準(zhǔn)確性，我們必須要求無(wú)菌室以及工作臺(tái)符合要求,，那我們應(yīng)該怎樣進(jìn)行驗(yàn)證呢,？下面我們介紹一下環(huán)境中無(wú)菌或殺菌效果應(yīng)如何檢查。
微生物檢測(cè)人員天天都需要在無(wú)菌室工作,，在超凈臺(tái)或者生物安全柜里操作,，為了保證我們檢測(cè)的準(zhǔn)確性，我們必須要求無(wú)菌室以及工作臺(tái)符合要求,，那我們應(yīng)該怎樣進(jìn)行驗(yàn)證呢,？下面我們介紹一下環(huán)境中無(wú)菌或殺菌效果應(yīng)如何檢查。
一,、紫外燈殺菌效果檢查
紫外燈在使用過(guò)程中輻射強(qiáng)度會(huì)逐漸降低,，影響其殺菌效果，故應(yīng)該定期檢查,。紫外燈的殺菌有效波長(zhǎng)是253.7nm,，其強(qiáng)度可以用中心波長(zhǎng)254nm的紫外線強(qiáng)度計(jì)測(cè)定,。在沒(méi)有紫外線強(qiáng)度計(jì)的情況下可以采用生物學(xué)替代。
生物學(xué)測(cè)試簡(jiǎn)要步驟如下：選用枯草芽孢桿菌ATCC 9372,，制成106CFU/mL~108CFU/mL濃度的菌懸液,；選用經(jīng)脫脂處理的0.5cm×1.0cm大小的布片或鋁片，高壓滅菌后用作載體,；每個(gè)載體上滴一滴制備好的菌懸液,，干燥后備用；將8個(gè)染菌載體放于無(wú)菌器皿中,，置于紫外燈下1m~1.5m處,，開(kāi)啟紫外燈照射，于0.5h,、1h,、1.5h和2h各取出2個(gè)染菌載體，分別投入盛有5mL緩沖蛋白胨水的洗脫液,；系列稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)；同法取8個(gè)染菌載體用做陽(yáng)性對(duì)照,，操作除不經(jīng)紫外此昂照射外與試驗(yàn)組相同,。
殺滅率=（陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)-試驗(yàn)組回收菌數(shù)）/陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)×100%
殺滅率大于99.9%時(shí)，認(rèn)為紫外燈殺菌效果合格,。
二,、無(wú)菌室空氣質(zhì)量檢查
無(wú)菌室空氣質(zhì)量檢查應(yīng)按照采樣計(jì)劃，根據(jù)情況對(duì)處于空態(tài),、靜態(tài)和正常運(yùn)行的風(fēng)險(xiǎn)區(qū),，使用適當(dāng)?shù)膬x器采集空氣中微生物，測(cè)定并監(jiān)控風(fēng)險(xiǎn)區(qū)空氣的微生物污染,?？諝鈶腋∥⑸锏牟蓸雍陀?jì)數(shù)方法多種多樣，根據(jù)多需采樣目的決定具體的采樣方法和采樣器,。因采樣器的采集效率不同,，應(yīng)慎重選擇合適的方法和設(shè)備。采樣器分為兩類：被動(dòng)式采樣器,，如落菌盤,；主動(dòng)式采樣器，如過(guò)濾采樣器,、撞擊采樣器,、沖擊采樣器等。
1.沉降法
落菌盤等被動(dòng)式空氣微生物采樣器不能測(cè)量空氣中的微生物的總數(shù),，而是測(cè)量空氣中微生物在表面的沉降率,。只要確定單位時(shí)間落菌盤上微生物的數(shù)量,，再根據(jù)落菌盤的暴露面積與暴露時(shí)間之間的關(guān)系，即可大致計(jì)算出空氣中微生物的數(shù)量,。
面積小于30m2的室內(nèi)設(shè)一條對(duì)角線取3點(diǎn),，在其中心以及兩端距墻1m處各取1點(diǎn)；面積大于30m2的室內(nèi)房間四面距墻1m和中央各放置一個(gè)平皿,，高度為實(shí)驗(yàn)臺(tái)高度,。培養(yǎng)基平皿開(kāi)蓋暴露10min，然后蓋上蓋子倒放,，培養(yǎng)48h,，計(jì)數(shù)每個(gè)平皿上的菌落數(shù)。
日常監(jiān)控時(shí),，可以設(shè)定可接受的菌落數(shù)限值,。一般無(wú)菌室所有的取樣平皿上的細(xì)菌總數(shù)應(yīng)小于15個(gè)?？諝赓|(zhì)量良好的無(wú)菌室,，通常么個(gè)平皿上生長(zhǎng)的細(xì)菌不超過(guò)2個(gè)。
2.空氣過(guò)濾法：
空氣采樣除了自然沉降法外,，還可以使用專門的主動(dòng)式采樣器,。主動(dòng)式采樣器可以評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)區(qū)空氣微生物的特征。主動(dòng)式采樣器主要包括過(guò)濾采樣器,、撞擊采樣器,、沖擊采樣器等。
撞擊采樣器可以分為狹縫式采樣器,、離心式采樣器和針孔式采樣器,。狹縫式采樣器由附加的真空抽氣泵抽氣，通過(guò)采樣器的縫隙式平板,，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉(zhuǎn)的平板培養(yǎng)基表面上,，附著的活微生物粒子經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后形成菌落，予以計(jì)數(shù),。離心式采樣器由于內(nèi)部風(fēng)機(jī)的高速旋轉(zhuǎn),，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心機(jī)的作用下,，空氣中的活微生物粒子有足夠的時(shí)間撞擊到的固形培養(yǎng)條上,，經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落，予以計(jì)數(shù),。
過(guò)濾式空氣采樣器是zui常用,、zui簡(jiǎn)單的空氣采樣器。過(guò)濾式采樣器有采樣頭、濾器,、流量計(jì)和抽氣泵組成,。過(guò)濾式采樣器的結(jié)構(gòu)如圖：
開(kāi)動(dòng)電機(jī)后，抽氣泵工作,，帶動(dòng)空氣吸入采樣頭,，空氣通過(guò)濾器的時(shí)候，大于濾膜孔徑的顆粒被阻留,，當(dāng)達(dá)到預(yù)先設(shè)定吸氣體積后抽氣泵停止工作,，將濾膜取出轉(zhuǎn)貼到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后計(jì)算空氣中微生物的濃度,。過(guò)濾式采樣器捕獲效率高,，但是濾膜材料可能影響微生物的存活率，還有采樣阻力大,、流量易變的缺陷,。
在沒(méi)有空氣采樣器的情況下，可以自己組裝如下圖的空氣錯(cuò)率采樣裝置,，注意組裝連接處必須密不透風(fēng),。
打開(kāi)圖中大瓶的，空氣就被抽入無(wú)菌水中,。待4L水流完,，就有4L空氣通過(guò)小瓶中的無(wú)菌水，也就是4L空氣中的微生物被留存在50mL無(wú)菌水中,。無(wú)菌吸取1mL過(guò)濾的水樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，做2個(gè)平行,。37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù),。
每升空氣中的細(xì)菌數(shù)為：2個(gè)平皿上細(xì)菌數(shù)量的平均值×50/4。
三,、無(wú)菌室物體表面微生物污染檢查
表面微生物污染的檢查需要使用接觸器或拭子,，獲得某表面某時(shí)間點(diǎn)的微生物數(shù)量。
接觸器以容器內(nèi)已知面積的固態(tài)培養(yǎng)介質(zhì)與表面接觸,，接觸面積應(yīng)大于20cm2,，均勻用力將整個(gè)營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)壓住表面幾秒鐘，不得移動(dòng),。然后將裝置放回容器內(nèi),，再清潔采樣表面，清除殘留營(yíng)養(yǎng)物,。接觸器培養(yǎng)后顯現(xiàn)的菌落可以給出原表面微生物的存活狀況的鏡像“圖”,。
使用拭子更為簡(jiǎn)單和靈活，用拭子擦拭某個(gè)表面,，它抹去的微生物數(shù)量就可以計(jì)算出了,。對(duì)接觸裝置觸及不到的,、不平或有凹陷的非吸收性大表面，用拭子采樣特別方便,。棉拭子的操作方法如下：
準(zhǔn)備材料：自制無(wú)菌棉拭子或購(gòu)買商品化的無(wú)菌棉拭子,、內(nèi)徑10cm×10cm無(wú)菌規(guī)格板、無(wú)菌生理鹽水,、培養(yǎng)基平皿,。
如果取樣物體是平面的，將無(wú)菌規(guī)格板放在物體表面,，用浸濕的無(wú)菌棉拭子在無(wú)菌規(guī)格板空心處橫豎涂抹均勻,，涂抹時(shí)隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，剪去棉拭子與手接觸部分,，將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌生理鹽水中待檢,。
將采樣管敲打80次以上是棉拭子上的細(xì)菌充分?jǐn)U散，做適當(dāng)稀釋,，進(jìn)行平板計(jì)數(shù),，37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。
細(xì)菌總數(shù)（CFU/cm2）=（平皿上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/采樣面積（cm2）
四,、人員接觸面無(wú)菌檢查
人員與檢測(cè)對(duì)象的接觸面主要是受,。
被檢人員洗手消毒后，五指并攏,。將浸泡過(guò)的棉拭子沿雙手指屈從指根到指端往返涂擦兩次,，涂擦的同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子。剪去操作者手接觸部位,，將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌室生理鹽水中待檢,。
按“無(wú)菌室物體表面細(xì)菌污染檢查”的方法進(jìn)行樣品處理、接種,、培養(yǎng),、計(jì)數(shù)和報(bào)告結(jié)果。