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細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法

細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊,，然后是胞漿濃縮,、胞膜起泡,繼而細(xì)胞核裂解成若干碎片，細(xì)胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹,，胞漿內(nèi)形成多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody),。這不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞腫脹、胞膜破裂,、細(xì)胞崩解,。
       根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，至今為止,，已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法,。
 

 鏡像綺點(diǎn)依靠多年在細(xì)胞培養(yǎng)方面的積累，為客戶提供完整的細(xì)胞CRO解決方案,。根據(jù)客戶需求,，直接在細(xì)胞水平進(jìn)行藥物或者試劑的刺激，觀察細(xì)胞狀態(tài)的變化或者特定通路上mRNA或蛋白的變化,，也可以先制作動(dòng)物模型,，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處理后，分離特定的原代細(xì)胞進(jìn)行需要的檢測,。

    同時(shí),，我們可以依照客戶提供的具體實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行操作,，也可以根據(jù)客戶要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并根據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)的規(guī)模和難度提供詳細(xì)的報(bào)價(jià)和實(shí)驗(yàn)周期規(guī)劃,。

       一,、光學(xué)顯微鏡觀察

       凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊,，有時(shí)可碎裂,。在HE染色的組織切片中細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密,、嗜酸性染色增強(qiáng),，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞常以分散單個(gè)形式存在,，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離,，不引起炎癥反應(yīng)。
本方法簡便易行,，但在細(xì)胞密集的組織中對(duì)于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難,，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強(qiáng)的主觀性,，重復(fù)性差,。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一,。
       檢測方法：細(xì)胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色,，在高倍物鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變,，結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。
       二,、視頻時(shí)差顯微技術(shù)
       此方法用于細(xì)胞培養(yǎng)，通過相差顯微鏡可動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞凋亡的變化過程,，尤其是觀察細(xì)胞表和外形的變化,。凋胞與基質(zhì)分離,，胞體變圓、收縮,、出泡，有的細(xì)胞拉長,，出現(xiàn)釘狀突起,，特續(xù)數(shù)小時(shí)后細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞溶解,，通過連續(xù)觀察,，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細(xì)胞,，但不能用于病理組織,。
       檢測方法：收集2×105細(xì)胞/ml培胞,，置于多孔培養(yǎng)板,，加入凋亡誘導(dǎo)劑，在帶有自動(dòng)攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變,，每隔分鐘30秒作序列攝影,，連續(xù)24小時(shí),。如同進(jìn)進(jìn)行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影,。
       三、電子顯微鏡觀察

雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時(shí)期的變化,。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典,、可靠的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。

       缺點(diǎn)：
       (1)只能定性,不能定量;
       (2)標(biāo)本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對(duì)昂貴,對(duì)檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標(biāo)本檢測;
       (3)在組織切片上進(jìn)行電鏡觀察時(shí),有時(shí)凋亡很難與正常細(xì)胞有絲分裂相鑒別,因?yàn)閮煞N情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚,。如同時(shí)進(jìn)行熒光染色,可彌補(bǔ)電鏡檢查的不足。
       檢測方法：透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水,，環(huán)氧樹脂包埋,，超薄切片,，醋酸枸椽酸電子又重染色,，透射電鏡觀察,。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,，乙醇逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥,，真空噴金，掃描電鏡觀察,。
       四、流式細(xì)胞技術(shù)
       流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的,。細(xì)胞穿過流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射,，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息,。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種,，前向散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞大小,、體積相產(chǎn)，右向角射光的強(qiáng)度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的析射性,、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。

細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法
       細(xì)胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞皺縮、胞膜起泡,、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變,。早期凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強(qiáng)或不變，前者反映了細(xì)胞的皺縮,，后者反映了細(xì)胞的核逐縮及碎裂,。晚期凋亡細(xì)胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。
       由于光散射牧場生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱,。因此,，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞,。
       細(xì)胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出,，核DNA含量下降,，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰,，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞,。
       根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率,。此外,，流式細(xì)胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細(xì)胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。
       檢測方法：獲取密度1×106細(xì)胞/ml左右的細(xì)胞懸液,，精洗，固定,，熒光染料染色,，上流式細(xì)胞儀分析,。                                     

一站式細(xì)胞解決方案

    針對(duì)基礎(chǔ)及臨床研發(fā)中的原代細(xì)胞和iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，由于原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)難度大,，iPS細(xì)胞制作和分化的實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,，除長期進(jìn)行原代和iPS培養(yǎng)工作的實(shí)驗(yàn)室，想要獲得足夠量的狀態(tài)好的細(xì)胞比較困難,。

服務(wù)流程：

    1.聯(lián)系我們,，溝通客戶實(shí)驗(yàn)計(jì)劃及目標(biāo),，評(píng)估實(shí)驗(yàn)的的可行性,。    

    2.依照客戶要求,，設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn),；或客戶已有實(shí)驗(yàn)方案發(fā)送給我們，我們研究方案的可操作性,。    

    3.確定終的實(shí)驗(yàn)方案,，報(bào)價(jià)和周期。    

    4.簽訂服務(wù)合同,，支付預(yù)付款,。    

    5.開始實(shí)驗(yàn)服務(wù)，并定期向客戶反饋和交流,。    

    6.實(shí)驗(yàn)完成,，提供完整實(shí)驗(yàn)說明和部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。    

    7.支付尾款,，向客戶提供完整的全部實(shí)驗(yàn)報(bào)告和原始數(shù)據(jù),。    

    8.項(xiàng)目完成。