日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

MTT檢測法,，是一種檢測細(xì)胞存活和生長增殖的方法。
檢測原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,，而死細(xì)胞無此功能,。二甲基亞砜(DMSO )能溶解細(xì)胞中的甲瓚,，用酶標(biāo)儀在490nm波長（或其他波長）處測定其光吸收值,，在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,。根據(jù)測得的吸光度值(OD值),，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大,，細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小),。
該方法靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用,，已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測,、大規(guī)模藥物篩選,、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及細(xì)胞放射敏感性測定等等,。

MTT主要有兩個用途：（1）藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定,；（2）細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定,。

MTT法細(xì)胞活性檢測

MTT方法能簡單,、快捷,、準(zhǔn)確地測定細(xì)胞的增殖反應(yīng)，并且其價(jià)格低廉,，成為日前各實(shí)驗(yàn)室檢測細(xì)胞活性的shou選方法之一。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中,，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚,，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值,，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,。根據(jù)測得的吸光度值（OD值）來判斷活細(xì)胞數(shù)量,，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測藥物毒性,，則表示藥物毒性越?。?/p>

一,、MTT 溶液的配制

1,、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml，須用PBS或生理鹽水做溶劑,。

市面上一般MTT的包裝為100mg,，250mg或1g。對于100mg這樣的小包裝,，廠家都是將MTT放入小管中的,，個人建議不要再用天平稱量分裝,，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液,，如100mg用20mlPBS來溶解,。具體做法：預(yù)先在50ml離心管（沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS,，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中,，吹打若干次后將其移入50ml離心管,，然后再混勻,?？梢灾貜?fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi),。將MTT*混勻后,，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌,，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20℃,。按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計(jì)算,，一般每96孔板約需1ml,，所以分裝時(shí)可考慮每管分裝1ml,。對于大包裝,，可按上述方法稱取一部分溶解,，也有人將粉劑分裝在EP管里,，用的時(shí)候現(xiàn)配,，直接往培養(yǎng)板中加,。

2,、注意事項(xiàng)：

（1）在配制和保存的過程中,，容器用鋁箔紙包住。

（2）配成的MTT需要無菌,，MTT對菌很敏感。

（3）MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配,，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效,，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融,，小劑量分裝,，用避光袋或是黑紙,、錫箔紙包住避光以免分解,。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就不能再用。

（4）MTT有致癌性,，使用時(shí)需小心。

MTT法細(xì)胞活性檢測

二,、MTT甲瓚溶解液

1,、二甲基亞砜DMSO：可以直接溶解，無需配制,，使用方便,，溶解速度快，但對人體毒性較大,，且需去除原培養(yǎng)液,，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結(jié)晶去掉,，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定,。

2、三聯(lián)溶解液：SDS10g,，異丁醇5ml,，10M HCl 0.1ml，用雙蒸水溶解配成100ml溶液,，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基,，但溶解較慢。該溶解液因含有SDS,，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶,，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用,。

三,、MTT法實(shí)驗(yàn)步驟

1、yi酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集,，制成細(xì)胞懸液,，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5-10×104/ml。

2,、將細(xì)胞懸液制備好后,，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細(xì)胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）,。

注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降,，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加6個孔就混勻一次,，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間*相同,，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。

3,、將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物,。原則上,，細(xì)胞貼壁后即可加藥（兩小時(shí)——半天時(shí)間），但我們常在前一天下午鋪板,，次日上午加藥,。一般5-7個梯度，每孔100ul,，設(shè)3-5個復(fù)孔,，建議設(shè)6個，否則難以反應(yīng)真shi情況,。

注意：對于加藥,，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度,。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好,，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確,。另外,，需注意的是，如果用這種方法,，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥,，應(yīng)該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細(xì)胞死亡,。

4,、5%CO2，37℃孵育16-48h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果,。

5,、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml,，即0.5%MTT）,，繼續(xù)培養(yǎng)4h。

6,、終止培養(yǎng),，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。

溶解結(jié)晶的方法有兩種,，用DMSO溶解：

1)用DMSO溶解： MTT加入培養(yǎng)4h后,，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉,，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走,。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙?jiān)谧烂?，然后?6孔板輕輕倒置,，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失,。

2) 每孔加入150ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值,。

另一種方法，用三聯(lián)溶解液：

1) MTT加入培養(yǎng)4h后,，結(jié)晶可充分形成,。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液,。（該溶解液因含有SDS,，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫,，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用,。）

2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時(shí)，鏡下觀察,，待結(jié)晶全部溶解后570nm測吸光度,。通常37℃孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會全部溶解,。如果紫色結(jié)晶較小較少,，溶解的時(shí)間會短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時(shí)間會長一些,。

7,、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT,、二甲基亞砜）,，對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì),、培養(yǎng)液,、MTT、二甲基亞砜）,。

四,、MTT結(jié)果分析

關(guān)于如何計(jì)算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm：lg 大劑量

I：lg(大劑量/相臨劑量)

P0：陽性反應(yīng)率之和

Pm：大陽性反應(yīng)率

Pn：小陽性反應(yīng)率