骨骼肌細胞是人和動物體內(nèi)最大的細胞之一，它們是由成肌細胞(Myoblasts)融合而來的多核細胞,，故骨骼肌的形成是一個非常復(fù)雜的過程,，并需要多種細胞信號通路的參與，包括phosphatidylinositol 3-kinase,，calcineurin,，STAT3和MAPK等。原代骨骼肌細胞的培養(yǎng)是研究細胞分化過程的有效的模型,。
該細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因,。
細胞來源于正常動物肌肉組織，通過肌動蛋白（α-actin）免疫熒光染色鑒定為陽性,，細胞純度高于90%,。細胞形態(tài)位梭形，不規(guī)則細胞,，貼壁培養(yǎng),。
1.試驗所需儀器設(shè)備及試劑
（1）儀器
儀器名稱 | 規(guī)格型號 | 廠家 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X | 濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司 |
CO2細胞培養(yǎng)箱 | BC-J160S | 上海博迅實業(yè)有限公司 |
熒光倒置顯微鏡 | DS-Ri2 | Nikon |
高速冷凍離心機 | Multifuge X1R | Thermo Fisher |
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 | DHG-9123A | 上海精宏實驗設(shè)備有限公司 |
電熱恒溫震蕩水槽 | DK-2B | 上海精宏實驗設(shè)備有限公司 |
（2）試劑耗材
試劑名稱 | 規(guī)格/貨號 | 廠家 |
T25細胞培養(yǎng)瓶 | 430639 | Corning |
血球計數(shù)板 | Neubauer improved | Marienfeld |
24孔板專用細胞爬片 | YA0350 | Solarbio |
細胞培養(yǎng)孔板 | WHB-24 | 上海臥宏生物科技有限公司 |
胎牛血清 | 1414426 | Gibco |
骨骼肌衛(wèi)星細胞專用培養(yǎng)基 | Primed-iCell-018 | 賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司 |
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA） | 1734858 | Gibco |
Collagenase Ⅰ | 17018029 | Gibco |
Collagenase Ⅱ | 17101015 | Gibco |
Collagenase Ⅳ | 17104019 | Gibco |
多聚甲醛（PFA） | P1110 | Solarbio |
DAPI | C0060 | Solarbio |
Triton X-100 | T8200 | Solarbio |
山羊血清 | SL038 | Solarbio |
Myod | 18943-1-AP | Proteintech |
CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | SA00013-4 | Proteintech |
Fluoromount-G熒光封片劑 | 0100-01 | SourthernBiotech |
2．豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離培養(yǎng)
1) 首先將豬頸部動脈放血致死,。
2) 小心剪取后肢肌肉,，剔除脂肪，筋膜,，血管等,，
3) 用PBS漂洗肌肉2-3次，
4) 將肌肉組織剪碎,，
5) 加入3倍體積的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型膠原酶4℃冰箱過夜消化,，
6) 第二天，將混合液取出置于37℃水浴鍋中震蕩消化1h,，
7) 過100目篩網(wǎng)，
8) 收集濾液,，
9) 300g 離心5 min,，
10) 重懸沉淀,，鋪瓶
細胞分離培養(yǎng)：
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原圖見文件-細胞分離培養(yǎng)
3．免疫熒光鑒定
3.1實驗步驟
（1）細胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1mL,，加入細胞0.02million個/孔,。置培養(yǎng)箱2h或過夜,。
（2）固定
細胞爬片后,，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍,，加入4% PFA于4℃固定30min,。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,，放4℃過夜,。
（3）破膜封閉
將玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上,，
玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合,，再加10% 血清，
取50uL破膜封閉液滴于防水膜上,，將玻片上有細胞的一面蓋上2h,。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋
破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中）,，將玻片（有細胞的一面）蓋上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后,，PBS洗3×5min/次,，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min,，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G,，將有細胞的一面蓋上,。
鑒定細胞為P1代細胞
一抗為Myod
3.2免疫熒光鑒定結(jié)果
100X-DAPI 100X-Fluorescence
原圖見文件-免疫熒光
4.轉(zhuǎn)染
4.1SV40過表達慢病毒基本信息
實驗信息表： | ||||
產(chǎn)品名稱 | SV40過表達慢病毒 | |||
載體信息 | 載體元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
攜帶熒光標記 | GFP □ RFP□ | 抗性基因標記 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
載體圖譜 |
| |||
載體目的序列信息如下： gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat gaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatgg aactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaaca ttctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttg ctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacat actgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttg atgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaac aagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgttt aaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgcc aacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggat ataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaa aatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtgggggg aaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggagggga gtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaa agaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagatt atttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattg gagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcag ggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggtttt acttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacg ttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黃色區(qū)域為目的序列區(qū) | ||||
4.2轉(zhuǎn)染
（1）將細胞接種6孔板,，每孔細胞數(shù)約為1×105 個，
（2）第二天,，待細胞貼壁后,，換液，
（3）加入1mLwan全培養(yǎng)基,，再加20 μL SV40過表達慢病毒,，
（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，
（5）12h后觀察細胞狀態(tài),，并更換為新鮮培養(yǎng)基,，
（6）當細胞長滿板底后,，傳代至T25培養(yǎng)瓶中。
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原圖見文件-轉(zhuǎn)染
5.篩選
5.1殺滅曲線的確定
（1）將未轉(zhuǎn)染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板,，孵育過夜，
（2）第二天,，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基,，
（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1μg/mL，2μg/mL,，3μg/mL,，4μg/mL，5μg/mL,，6μg/mL,，7μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細胞的24孔板，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,，
（5）每天觀察細胞的存活比例,，
（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開始1-4d內(nèi)殺死所有細胞的zui低篩選濃度。
結(jié)果：嘌呤霉素的使用濃度為2μg/mL,，作用時間為2d,。
5.2嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細胞
（1）第一天，將轉(zhuǎn)染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板,，孵育過夜
（2）第二天,，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，
（3）加入含嘌呤霉素（2μg/mL）的篩選培養(yǎng)基,，孵育,，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，
（5）每天觀察細胞的存活比例,，
（6）在同一時間點（2d）存活的細胞,，即為轉(zhuǎn)染成功的細胞，
（7）對篩選后的細胞進行擴增,。
6.細胞擴增
將篩選后的細胞進行擴增,，篩選后的細胞為P1代，擴增至少到12代,。
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