骨骼肌細(xì)胞是人和動(dòng)物體內(nèi)最大的細(xì)胞之一，它們是由成肌細(xì)胞(Myoblasts)融合而來(lái)的多核細(xì)胞,，故骨骼肌的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,，并需要多種細(xì)胞信號(hào)通路的參與，包括phosphatidylinositol 3-kinase,，calcineurin,，STAT3和MAPK等。原代骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)是研究細(xì)胞分化過(guò)程的有效的模型,。
該細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因,。
細(xì)胞來(lái)源于正常動(dòng)物肌肉組織，通過(guò)肌動(dòng)蛋白（α-actin）免疫熒光染色鑒定為陽(yáng)性,，細(xì)胞純度高于90%,。細(xì)胞形態(tài)位梭形，不規(guī)則細(xì)胞,，貼壁培養(yǎng),。
1.試驗(yàn)所需儀器設(shè)備及試劑
（1）儀器
儀器名稱 | 規(guī)格型號(hào) | 廠家 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X | 濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司 |
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 | BC-J160S | 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司 |
熒光倒置顯微鏡 | DS-Ri2 | Nikon |
高速冷凍離心機(jī) | Multifuge X1R | Thermo Fisher |
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 | DHG-9123A | 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 |
電熱恒溫震蕩水槽 | DK-2B | 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 |
（2）試劑耗材
試劑名稱 | 規(guī)格/貨號(hào) | 廠家 |
T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 | 430639 | Corning |
血球計(jì)數(shù)板 | Neubauer improved | Marienfeld |
24孔板專用細(xì)胞爬片 | YA0350 | Solarbio |
細(xì)胞培養(yǎng)孔板 | WHB-24 | 上海臥宏生物科技有限公司 |
胎牛血清 | 1414426 | Gibco |
骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞專用培養(yǎng)基 | Primed-iCell-018 | 賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司 |
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA） | 1734858 | Gibco |
Collagenase Ⅰ | 17018029 | Gibco |
Collagenase Ⅱ | 17101015 | Gibco |
Collagenase Ⅳ | 17104019 | Gibco |
多聚甲醛（PFA） | P1110 | Solarbio |
DAPI | C0060 | Solarbio |
Triton X-100 | T8200 | Solarbio |
山羊血清 | SL038 | Solarbio |
Myod | 18943-1-AP | Proteintech |
CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | SA00013-4 | Proteintech |
Fluoromount-G熒光封片劑 | 0100-01 | SourthernBiotech |
2．豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)
1) 首先將豬頸部動(dòng)脈放血致死。
2) 小心剪取后肢肌肉,，剔除脂肪,，筋膜，血管等,，
3) 用PBS漂洗肌肉2-3次,，
4) 將肌肉組織剪碎，
5) 加入3倍體積的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型膠原酶4℃冰箱過(guò)夜消化,，
6) 第二天,，將混合液取出置于37℃水浴鍋中震蕩消化1h，
7) 過(guò)100目篩網(wǎng),，
8) 收集濾液,，
9) 300g 離心5 min,，
10) 重懸沉淀，鋪瓶
細(xì)胞分離培養(yǎng)：
100x 200x
原圖見(jiàn)文件-細(xì)胞分離培養(yǎng)
3．免疫熒光鑒定
3.1實(shí)驗(yàn)步驟
（1）細(xì)胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中,，每孔加入培養(yǎng)基1mL，加入細(xì)胞0.02million個(gè)/孔,。置培養(yǎng)箱2h或過(guò)夜,。
（2）固定
細(xì)胞爬片后，吸出培養(yǎng)基,，用PBS洗1遍,，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次,。也可最后一次不吸出PBS,，放4℃過(guò)夜。
（3）破膜封閉
將玻片除去水分,，置于培養(yǎng)皿支撐物上,，
玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清,，
取50uL破膜封閉液滴于防水膜上,，將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋
破膜封閉后,，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中）,，將玻片（有細(xì)胞的一面）蓋上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次,，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min,，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G,，將有細(xì)胞的一面蓋上,。
鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞
一抗為Myod
3.2免疫熒光鑒定結(jié)果
100X-DAPI 100X-Fluorescence
原圖見(jiàn)文件-免疫熒光
4.轉(zhuǎn)染
4.1SV40過(guò)表達(dá)慢病毒基本信息
實(shí)驗(yàn)信息表： | ||||
產(chǎn)品名稱 | SV40過(guò)表達(dá)慢病毒 | |||
載體信息 | 載體元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
攜帶熒光標(biāo)記 | GFP □ RFP□ | 抗性基因標(biāo)記 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
載體圖譜 |
| |||
載體目的序列信息如下： gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat gaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatgg aactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaaca ttctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttg ctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacat actgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttg atgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaac aagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgttt aaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgcc aacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggat ataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaa aatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtgggggg aaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggagggga gtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaa agaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagatt atttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattg gagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcag ggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggtttt acttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacg ttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黃色區(qū)域?yàn)槟康男蛄袇^(qū) | ||||
4.2轉(zhuǎn)染
（1）將細(xì)胞接種6孔板,，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105 個(gè)，
（2）第二天,，待細(xì)胞貼壁后,，換液，
（3）加入1mLwan全培養(yǎng)基,，再加20 μL SV40過(guò)表達(dá)慢病毒,，
（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，
（5）12h后觀察細(xì)胞狀態(tài),，并更換為新鮮培養(yǎng)基,，
（6）當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后，傳代至T25培養(yǎng)瓶中,。
100x 200x
原圖見(jiàn)文件-轉(zhuǎn)染
5.篩選
5.1殺滅曲線的確定
（1）將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過(guò)夜,，
（2）第二天,，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，
（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1μg/mL,，2μg/mL,，3μg/mL，4μg/mL,，5μg/mL,，6μg/mL，7μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細(xì)胞的24孔板,，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,，
（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例，
（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開(kāi)始1-4d內(nèi)殺死所有細(xì)胞的zui低篩選濃度,。
結(jié)果：嘌呤霉素的使用濃度為2μg/mL,，作用時(shí)間為2d。
5.2嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞
（1）第一天,，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板,，孵育過(guò)夜
（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基,，
（3）加入含嘌呤霉素（2μg/mL）的篩選培養(yǎng)基,，孵育，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,，
（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例,，
（6）在同一時(shí)間點(diǎn)（2d）存活的細(xì)胞，即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,，
（7）對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,。
6.細(xì)胞擴(kuò)增
將篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，篩選后的細(xì)胞為P1代,，擴(kuò)增至少到12代,。
100x 200x
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
7
立即詢價(jià)
您提交后,，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)