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鏡像綺點(diǎn)(上海)細(xì)胞技術(shù)...

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豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定,、轉(zhuǎn)染方法

閱讀:666      發(fā)布時(shí)間:2024-5-15
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骨骼肌細(xì)胞是人和動(dòng)物體內(nèi)最大的細(xì)胞之一,它們是由成肌細(xì)胞(Myoblasts)融合而來(lái)的多核細(xì)胞,,故骨骼肌的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,,并需要多種細(xì)胞信號(hào)通路的參與,包括phosphatidylinositol 3-kinase,,calcineurin,,STAT3和MAPK等。原代骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)是研究細(xì)胞分化過(guò)程的有效的模型,。

該細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因,。

細(xì)胞來(lái)源于正常動(dòng)物肌肉組織,通過(guò)肌動(dòng)蛋白(α-actin)免疫熒光染色鑒定為陽(yáng)性,,細(xì)胞純度高于90%,。細(xì)胞形態(tài)位梭形,不規(guī)則細(xì)胞,,貼壁培養(yǎng),。

1.試驗(yàn)所需儀器設(shè)備及試劑

(1)儀器

儀器名稱

規(guī)格型號(hào)

廠家

生物安全柜

BSC-1500ⅡA2-X

濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱

BC-J160S

上海博迅實(shí)業(yè)有限公司

熒光倒置顯微鏡

DS-Ri2

Nikon

高速冷凍離心機(jī)

Multifuge X1R

Thermo Fisher

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱

DHG-9123A

上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

電熱恒溫震蕩水槽

DK-2B

上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

(2)試劑耗材

試劑名稱

規(guī)格/貨號(hào)

廠家

T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

430639

Corning

血球計(jì)數(shù)板

Neubauer improved

Marienfeld

24孔板專用細(xì)胞爬片

YA0350

Solarbio

細(xì)胞培養(yǎng)孔板

WHB-24

上海臥宏生物科技有限公司

胎牛血清

1414426

Gibco

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞專用培養(yǎng)基

Primed-iCell-018

賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司

0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)

1734858

Gibco

Collagenase Ⅰ

17018029

Gibco

Collagenase Ⅱ

17101015

Gibco

Collagenase Ⅳ

17104019

Gibco

多聚甲醛(PFA)

P1110

Solarbio

DAPI

C0060

Solarbio

Triton X-100

T8200

Solarbio

山羊血清

SL038

Solarbio

Myod

18943-1-AP

Proteintech

CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)

SA00013-4

Proteintech

Fluoromount-G熒光封片劑

0100-01

SourthernBiotech

2.豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1) 首先將豬頸部動(dòng)脈放血致死。

2) 小心剪取后肢肌肉,,剔除脂肪,,筋膜,血管等,,

3) 用PBS漂洗肌肉2-3次,,

4) 將肌肉組織剪碎,

5) 加入3倍體積的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型膠原酶4℃冰箱過(guò)夜消化,,

6) 第二天,,將混合液取出置于37℃水浴鍋中震蕩消化1h,

7) 過(guò)100目篩網(wǎng),,

8) 收集濾液,,

9) 300g 離心5 min,,

10) 重懸沉淀,鋪瓶

細(xì)胞分離培養(yǎng):

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定,、轉(zhuǎn)染方法

                                100x                                                     200x

原圖見(jiàn)文件-細(xì)胞分離培養(yǎng)

3.免疫熒光鑒定

3.1實(shí)驗(yàn)步驟

(1)細(xì)胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中,,每孔加入培養(yǎng)基1mL,加入細(xì)胞0.02million個(gè)/孔,。置培養(yǎng)箱2h或過(guò)夜,。

(2)固定

細(xì)胞爬片后,吸出培養(yǎng)基,,用PBS洗1遍,,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次,。也可最后一次不吸出PBS,,放4℃過(guò)夜。

(3)破膜封閉

將玻片除去水分,,置于培養(yǎng)皿支撐物上,,

玻璃片封閉液配置:0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合,再加10% 血清,,

取50uL破膜封閉液滴于防水膜上,,將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h。

(4)一抗孵育

一抗配制:抗體與PBS 1:100(200)稀釋

破膜封閉后,,取50uL一抗于防水膜上(濕盒中),,將玻片(有細(xì)胞的一面)蓋上置于4℃(最多可放置一周)

(5)二抗孵育

室溫避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,,PBS洗3×5min/次。

(6)包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G,,將有細(xì)胞的一面蓋上,。

鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞

一抗為Myod

3.2免疫熒光鑒定結(jié)果

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定、轉(zhuǎn)染方法

                        100X-DAPI                               100X-Fluorescence                

原圖見(jiàn)文件-免疫熒光

4.轉(zhuǎn)染

4.1SV40過(guò)表達(dá)慢病毒基本信息

實(shí)驗(yàn)信息表:

產(chǎn)品名稱

SV40過(guò)表達(dá)慢病毒

載體信息

載體元件信息

EF1α-SV40-IRES-puromycin

攜帶熒光標(biāo)記

GFP □   RFP□

抗性基因標(biāo)記

Puromycin □  Blasticidin □

載體圖譜

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定,、轉(zhuǎn)染方法

載體目的序列信息如下:

gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta

ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat

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黃色區(qū)域?yàn)槟康男蛄袇^(qū)

4.2轉(zhuǎn)染

(1)將細(xì)胞接種6孔板,,每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105 個(gè),

(2)第二天,,待細(xì)胞貼壁后,,換液,

(3)加入1mLwan全培養(yǎng)基,,再加20 μL SV40過(guò)表達(dá)慢病毒,,

(4)混勻后繼續(xù)培養(yǎng),

(5)12h后觀察細(xì)胞狀態(tài),,并更換為新鮮培養(yǎng)基,,

(6)當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后,傳代至T25培養(yǎng)瓶中,。

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定,、轉(zhuǎn)染方法

                               100x                                             200x

原圖見(jiàn)文件-轉(zhuǎn)染

5.篩選

5.1殺滅曲線的確定

(1)將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板,孵育過(guò)夜,,

(2)第二天,,除去24孔板中舊的培養(yǎng)基,

(3)將含不同濃度嘌呤霉素(1μg/mL,,2μg/mL,,3μg/mL,4μg/mL,,5μg/mL,,6μg/mL,7μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細(xì)胞的24孔板,,

(4)每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,,

(5)每天觀察細(xì)胞的存活比例,

(6)最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開(kāi)始1-4d內(nèi)殺死所有細(xì)胞的zui低篩選濃度,。

結(jié)果:嘌呤霉素的使用濃度為2μg/mL,,作用時(shí)間為2d。

5.2嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞

(1)第一天,,將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板,,孵育過(guò)夜

(2)第二天,除去24孔板中舊的培養(yǎng)基,,

(3)加入含嘌呤霉素(2μg/mL)的篩選培養(yǎng)基,,孵育,

(4)每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,,

(5)每天觀察細(xì)胞的存活比例,,

(6)在同一時(shí)間點(diǎn)(2d)存活的細(xì)胞,即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,,

(7)對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,。

6.細(xì)胞擴(kuò)增

將篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,篩選后的細(xì)胞為P1代,,擴(kuò)增至少到12代,。

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定、轉(zhuǎn)染方法

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