IF實驗
免疫熒光技術(shù)
原理：免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素,，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量,。
步驟：
細胞準備：對單層生長細胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
固定：根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月,。PBS洗滌3×5 min.
通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前,，對細胞進行通透處理,，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì),。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
封閉：使用封閉液對細胞進行封閉,，時間一般為30min.
一抗結(jié)合：室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,，每次沖洗5min.
二抗結(jié)合：間接免疫熒光需要使用二抗,。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后,，再用蒸餾水漂洗一次,。
封片及檢測：滴加封片劑一滴，封片,，熒光顯微鏡檢查,。
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