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　　IF實驗

　　免疫熒光技術

　　原理：免疫熒光技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理,，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素,，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原（或抗體）,。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,，以及利用定量技術測定含量,。

　　步驟：

　　細胞準備：對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時,，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次,；對懸浮生長細胞,，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片,。

　　固定：根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎９潭ㄍ戤吅蟮募毎芍糜诤B氮納的PBS中4℃保存3個月,。PBS洗滌3×5 min.

　　通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞,，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理,，以保證抗體能夠到達抗原部位,。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

　　封閉：使用封閉液對細胞進行封閉,，時間一般為30min.

　　一抗結(jié)合：室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,，每次沖洗5min.

　　二抗結(jié)合：間接免疫熒光需要使用二抗,。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后,，再用蒸餾水漂洗一次,。

　　封片及檢測：滴加封片劑一滴,，封片，熒光顯微鏡檢查,。