在制作原代細(xì)胞免疫熒光時,容易出現(xiàn)一些問題,,造成熒光鑒定失敗,,將抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)時,,一定要注意抗體的比例高低和濃度,。
制作免疫熒光常用的方法有:
方法一:直接法
步驟:將熒光標(biāo)記的特異性抗體(抗原)直接加在抗原(抗體)上,,經(jīng)一定的溫度和時間染色,水洗—干燥—封片—鏡檢
優(yōu)點:操作簡便,、特異性高,、非特異性染色少
缺點:敏感性低
方法二:間接法
步驟:先用已知未標(biāo)記的特異性抗體(一抗)與抗原反應(yīng),再用標(biāo)記的抗體(二抗)與其反應(yīng),,形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物,,水洗—干燥—封片—鏡檢
優(yōu)點:敏感性強,目前多采用間接法
缺點:操作復(fù)雜
實驗過程中常見的問題:
1,,整個細(xì)胞片都出現(xiàn)熒光高點
原因有二:一是二抗?jié)舛冗^高,,適當(dāng)降低二抗?jié)舛燃纯伞6嵌拱l(fā)生沉淀,,可以使用過濾或者離心熒光標(biāo)記二抗
2,信號弱或無信號,,染色細(xì)胞過少
目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中沒有表達(dá),,需要制備細(xì)胞裂解液,用Western Blotting驗證目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中是否表達(dá),。
表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞過少,,標(biāo)本中使用更多的細(xì)胞,試用其他瞬時轉(zhuǎn)染方法,,或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,。
細(xì)胞通透性差,需要增加通透劑作用的時間或者濃度,,或改用其它的通透劑
染色前的固定步驟破壞了抗原表位,,改用其他固定方法。
通透使抗原丟失,,可以減少通透劑作用的時間或強度,。
抗體不識別,需要換用其他抗體
一抗稀釋度過大,,使用同一樣品按*的二抗用量作一抗稀釋曲線,,以確定*的一抗稀釋比例。
二抗選擇錯誤,,要使用正確的二抗
3,,鏡下觀察只有DAPI的藍(lán)光,目的熒光幾乎沒有或者很弱
出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低,,需提高抗體濃度,,可配合提高二抗?jié)舛龋还簿劢沟募ぐl(fā)熒光強度不夠大,;二抗孵育時是否是對應(yīng)的種屬,,比如本來需要山羊抗鼠結(jié)果加為山羊抗兔,。
4,細(xì)胞核周圍總是存在有一些藍(lán)色的小點點
這種情況一般是支原體污染所致,,建議用殺支原體藥2周后再檢測,,或者通過提高共聚焦機器背景值來覆蓋支原體熒光
5,如何共定位的視野
共定位時,,首先判斷哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)染成功的,,比如我過表達(dá)了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位關(guān)系,,則在視野中尋找已成功轉(zhuǎn)染蛋白A的細(xì)胞,,一般熒光強度會顯著高于周邊其他細(xì)胞,再在這個細(xì)胞上觀察蛋白B的表達(dá),。
6,,視野中細(xì)胞與細(xì)胞之間存在散在的發(fā)光點
有兩種情況可造成:1,拍照時PBS量過少引起的非特異性,;2,,PBS未過濾,未溶解的殘渣黏附而導(dǎo)致
三,、除此之外,,這些注意事項也要牢記
1、合適的抗體稀釋比例
通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色,,通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果,。但在能保證低背景染色的前提下,可以通過增加濃度來提高信號強度,。如果是*次使用該抗體或測定某抗原,,強烈建議濃度梯度實驗。
2,、抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體,,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果。在大多數(shù)情況下,,純化抗體的效果很好,,但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子
3,、細(xì)胞固定和通透
為達(dá)到*的檢測效果,,細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵,,細(xì)胞和抗原需要保證*的結(jié)構(gòu),,并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下,需要通過以下步驟得以實現(xiàn):細(xì)胞用2%-4%多聚甲醛固定,,之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進(jìn)行通透,。前者是比較溫柔的處理,但是對于核內(nèi)抗原可能無效,,需要用到Triton,。使用皂角苷進(jìn)行通透時,要注意它會引起細(xì)胞膜的可逆性通透,,也就是除了在通透初期,,在每個抗體孵育環(huán)節(jié)都需要進(jìn)行通透。另外,,細(xì)胞可以用冰甲醇進(jìn)行同時固定和通透,,可以避免去垢劑的使用。
4,、封閉條件的優(yōu)化選擇
為了防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合,,需要在一抗孵育前用封閉液封閉,這樣可以減少非特異性的背景著色,。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清,,一般來說,血清價格比較昂貴,,可以用1%-5%BSA替代,BSA可以說是的封閉血清,。另外封閉時間不易過長,,30-60min即可,且封閉后不用洗滌,,直接加一抗孵育即可,。
5、一抗二抗的選擇
封閉過后需要一抗孵育,,可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h,,以筆者的經(jīng)驗是一抗孵育4度過夜比較好,抗原抗體結(jié)合會比較充分,。一抗二抗的稀釋比例可以根據(jù)抗體說明書來,,再根據(jù)自己具體的實驗要求進(jìn)行優(yōu)化。如果抗體濃度過低,,會造成信號太弱,,如果抗體濃度過高可能會造成背景染色太強。熒光二抗個人感覺Alex flour熒光基團信號強于Dylight強于FITC,。如果做免疫雙標(biāo),,一抗要來自不同種屬,熒光二抗的光譜也要分開。
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