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用于寬場顯微鏡的高速熒光壽命成像

快速的細(xì)胞過程,、移動的粒子和快速的圖像采集歷來是使用單光子計數(shù)技術(shù)進(jìn)行壽命成像的挑戰(zhàn)。寬場 FLIM 套件通過在寬場照明裝置中實(shí)現(xiàn)視頻速率壽命成像,，解決了這些限制,。該套裝將Pi Imaging的高分辨率SPAD5122 相機(jī)與PicoQuant的多功能脈沖激光器組合以及通過NovaLITE軟件進(jìn)行的GPU 加速FLIM分析結(jié)合在一起。它專為兼容光片和其他寬場顯微鏡系統(tǒng)而設(shè)計,，通過脈沖激發(fā)和時域門控檢測引入了FLIM功能,。NovaLITE簡化了數(shù)據(jù)分析，針對 TIFF 文件格式進(jìn)行了優(yōu)化,，確保了高效,、準(zhǔn)確的處理。

特點(diǎn)：

• 使用512x512像素時間門控SPAD相機(jī)進(jìn)行寬場壽命成像

• 比共焦FLIM快達(dá)100倍

• 結(jié)合落射熒光和光片顯微鏡進(jìn)行測試

• 激光選項適用于各種應(yīng)用

• 易于使用的基于GPU的分析軟件NovaLITE

應(yīng)用：

FLIM寬場顯微鏡的應(yīng)用

下面,，我們將重點(diǎn)介紹我們的寬視場FLIM套裝所擅長的兩個關(guān)鍵應(yīng)用： 光片F(xiàn)LIM和寬場FLIM,。從二維寬場顯微鏡到使用光片技術(shù)對活體樣本進(jìn)行三維成像，每一種應(yīng)用都展示了寬場FLIM套件在為高級生物研究提供高速,、高精度成像方面的多功能性,。

光片F(xiàn)LIM

在光片顯微鏡（或選擇性平面照明顯微鏡，SPIM）中,，樣品的一個平面被光片照射,，光片通常由圓柱透鏡或來回掃描的光束產(chǎn)生。被照亮的平面隨后通過相機(jī)成像,。光片顯微鏡因其快速,、柔和和三維功能，非常適合對大型活體樣本進(jìn)行研究,。壽命成像提供的傳感或同步多路復(fù)用與這些優(yōu)勢相輔相成,，使光片 FLIM 成為一種非常有效的組合。

我們與法國艾克斯-馬賽大學(xué)（Aix-Marseille Université）的研究人員合作,，擴(kuò)展了一種光片顯微鏡,，以實(shí)現(xiàn)光片F(xiàn)LIM。該顯微鏡是一種專門的單物鏡光片,，針對有機(jī)體的高通量成像進(jìn)行了優(yōu)化,。我們將該顯微鏡與用于脈沖照明的光纖耦合VisUV488和SPAD5122傳感器（高速版本）相結(jié)合，在類器官樣品上進(jìn)行FLIM,。

圖中顯示了光片 FLIM 如何用于同步多路復(fù)用,。我們對小鼠胚胎干細(xì)胞生成的活體器官進(jìn)行了成像。細(xì)胞核表達(dá) H2B-GFP,，細(xì)胞膜用 Flipper-TR 染色,。

下面的視頻顯示的是有機(jī)體的三維成像，通過生命周期進(jìn)行多路復(fù)用。對于該數(shù)據(jù)集,，光片由來回掃描的高斯光束產(chǎn)生（488nm波長下的平均功率約為70µW）,，每個Z平面的采集時間為1.1s?？潭染€為50µm,。

有關(guān)其他結(jié)果，包括不同光片模式與共焦 FLIM 的比較以及活體有機(jī)體的三維張力圖譜,，請查閱 bioRxiv 上的預(yù)印本,。

寬場 FLIM

在落射熒光寬場顯微鏡中，樣品的一個區(qū)域被準(zhǔn)直激光束照射,。然后將激發(fā)的熒光成像到相機(jī)上,。為了進(jìn)行寬場熒光成像，我們擴(kuò)展了一臺落射熒光顯微鏡（Olympus IX73）,，配備了用于照明的光纖耦合高功率530nm激光器（LDH P-FA-530XL）和高速版 SPAD5122傳感器,。

圖片顯示的是商用固定細(xì)胞樣本（Gattaquant，比例尺為5µm）的寬視場 FLIM 和共聚焦FLIM,。線粒體和微管蛋白用光譜重疊的染料標(biāo)記,，但可通過壽命區(qū)分開來,。即使在寬場 FLIM 上進(jìn)行 40ms的采集,，也能看到這種壽命對比。圖中顯示了隨著成像速度的增加,，壽命直方圖的范圍也在擴(kuò)大,。采集時間為300ms的寬場圖像和采集時間為 5s的共聚焦圖像的壽命直方圖都是雙峰的。不過,，共焦圖像中的生命周期分隔更大,。這并不是門控采集的偽影，而是落射熒光顯微鏡缺乏切片的結(jié)果,，在這種情況下,，焦內(nèi)和焦外的壽命是混合的。寬視場 FLIM 圖像是在激光輸出平均功率約為10mW 的情況下記錄的,，相當(dāng)于視場中約50W/cm2,。

寬場FLIM的高速性尤其有利于在對移動樣品成像時避免運(yùn)動模糊。視頻顯示了大型熒光珠在水中自由漂浮的實(shí)時畫面（比例尺10µm）,。溶液中含有兩種不同類型的珠子,，它們具有相似的光譜特性，但壽命不同,。在視頻中,，以每秒23幀的幀頻，可以根據(jù)熒光珠的壽命清楚地分辨出兩種類型的熒光珠,。

相關(guān)套件：

寬視場FLIM組件

照明選項

根據(jù)照明模式（如 Epi,、TIRF,、光片......）和樣品的不同，寬場 FLIM 應(yīng)用對照明光源的要求也大相徑庭,。在目前測試的應(yīng)用中,，所需的平均激光功率從數(shù)字掃描光片系統(tǒng)中的約 100 µW 到落射熒光寬場顯微鏡中的 25 mW 不等。我們將幫助您從 PicoQuant 大量的脈沖激光源組合中選擇適合您應(yīng)用的選項,。

標(biāo)準(zhǔn)光源：

• LDH系列：皮秒半導(dǎo)體激光頭

• Prima3色增益開關(guān)皮秒激光器

高功率光源：

• VisUV：紫外,、綠光、黃光和橙光皮秒激光器

• LDH-FA 系列：放大型皮秒脈沖半導(dǎo)體激光頭

探測器

探測器是Pi Imaging公司的SPAD5122 SPAD圖像傳感器,，像素為512x512,。該傳感器可通過納秒級的全局曝光進(jìn)行時間分辨檢測，并能以皮秒級的精度相對于激光脈沖進(jìn)行移動,。該傳感器采用微透鏡,，提高了填充因子，整體計數(shù)率高達(dá)15Gcps,。

*通常情況下,，套件默認(rèn)包括標(biāo)準(zhǔn)版本，如需高速版本,，請?zhí)崆皢栐儭?/p>

軟件

分析軟件 NovaLITE 讀取單個門控衰減測量值,，并進(jìn)行平均壽命、相位和擬合分析,。用戶可以直觀地將壽命顯示為直方圖或相位圖,。通過 GPU 加速擬合，可在數(shù)秒內(nèi)根據(jù)固定壽命擬合單次或多次指數(shù)衰減和物種分離,。結(jié)果可導(dǎo)出為 TIFF 格式,，以便進(jìn)一步處理。請注意,，NovaLITE 是一款純粹的分析軟件,，數(shù)據(jù)采集由 SPAD5122 軟件處理，用戶可通過遠(yuǎn)程接口將其集成到顯微鏡中,。PicoQuant 的分析軟件使用通用的 TIFF 文件格式,。這不是 SPAD5122 采集軟件的默認(rèn)格式，文件需要轉(zhuǎn)換,。

套裝包含：

• 一個或多個激光器,，用于所需波長的脈沖照明

• 512x512 像素 SPAD 陣列探測器（PI Imaging 公司的 SPAD5122高速單光子相機(jī)）

• 用于執(zhí)行快速 FLIM、擬合和相位分析的分析軟件

• 技術(shù)和應(yīng)用驅(qū)動遠(yuǎn)程支持

使用陣列探測器的門控FLIM原理

在共聚焦 FLIM 中,，通過掃描像素來依次獲取壽命圖像,。每個像素中的壽命信息與 TCSPC 檢測并行獲取，從而構(gòu)建壽命直方圖。相比之下,，在門控 FLIM 中,，整個圖像是并行采集的。然而,，壽命信息是通過相對于熒光壽命衰減移動門來依次獲取的,。時間分辨率是通過丟棄落在門外的光子生成的。因此,，成像速度,、時間分辨率甚至總探測效率都取決于采集參數(shù)，其方式比共焦熒光成像技術(shù)更為復(fù)雜,。