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分光光度計的使用
閱讀：1241 發(fā)布時間：2021-7-29分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,，通過系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后,，部分光源被吸收,，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,，單鏈、雙鏈DNA,，以及RNA,。核酸的高吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。
測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液,。然而,，實驗并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實上,，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度,。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,，都是正常的。
另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時,，離子濃度太高,，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。
這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）,。后是操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負值,；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和
樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個操作事項,。