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Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化地龍活性組分的凍干工藝
地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓 Pheretima
aspergillum (E. Perrier),，習稱“廣地龍”[1],，性味咸
寒，現(xiàn)代藥理研究表明,，地龍具有溶栓,、抗腫瘤,、
增強免疫力,、降壓鎮(zhèn)靜、改善微循環(huán)和心腦血管病
理狀態(tài),、調(diào)節(jié)肝臟等作用,，其主要活性成分是可溶
性蛋白質(zhì)[2-6]。有研究發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白是地龍溶血
栓,、抗血栓的主要活性物質(zhì)[7],。
目前,，對從地龍中提取得到地龍蛋白的工藝研
究較多[8-9]，但對已獲得的活性蛋白后續(xù)處理工藝的
研究較少,，因此本實驗旨在能夠zui大程度確保其活
性組分有效性的基礎(chǔ)上,，通過工藝處理后，較穩(wěn)定
地保存已提取蛋白,。本實驗采用單因素試驗結(jié)合
Box-Behnken 響應(yīng)面法[10],，以凍干率為指標，優(yōu)化
地龍活性組分的凍干工藝,，采用 HPLC 法,，測定優(yōu)
化后工藝樣品的指紋圖譜，并比較其與地龍藥材指
紋圖譜相似度,，確定*凍干工藝,，為地龍同體制
劑的研制提供實驗依據(jù)。
1 儀器與試劑
UV-2600 型紫外可見分光光度計,，日本島津公
司,；電子分析天平，梅特勒-托利多（上海）儀器有
限公司,；LYO-0.5（CIP）真空冷凍干燥機,，上海東
富龍科技股份有限公司；SPX-250BZ 型生化培養(yǎng)
箱,，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠,；TD-WS
臺式低速離心機，長沙湘鷹離心機有限公司,；安捷
倫 1260 液相色譜儀系統(tǒng),，美國安捷倫公司；相似度
軟件為“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,，中國
藥典委員會,。17 種氨基酸混合對照品（門冬氨酸、
谷氨酸,、絲氨酸,、甘氨酸、組氨酸,、精氨酸,、蘇氨
酸、丙氨酸,、脯氨酸,、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸,、
異亮氨酸,、亮氨酸、酪氨酸,、苯丙氨酸,、賴氨酸）、
衍生試劑 A（異硫氰酸苯酯-乙腈溶液）和衍生試劑
B（三乙胺-乙腈溶液）均來自月旭公司氨基酸分析
包,；尿激酶,、凝血酶（牛血）、纖維蛋白原（牛血）
均購自中國食品藥品檢定研究院,，批號分別為
140604-201224,、140605-201125、140607- 201338,；
瓊脂糖,，BR 級，批號 121129,，上海如吉生物科技
發(fā)展有限公司,；地龍對照藥材，批號 120987-201107,，
購自中國食品藥品檢定研究院,；實驗用水為娃哈哈
純凈水；其他試劑為分析純,。地龍藥材購自亳州中
藥材市場,，產(chǎn)地廣東佛山，批號 20131106,，經(jīng)湖北
省藥學會中藥鑒定分會陳科力教授鑒定為鉅蚓科動
物參環(huán)毛蚓 Pheretima aspergillum (E. Perrier) 的干
燥體,。
2 方法與結(jié)果
2.1 地龍藥材提取物的制備
稱取地龍粗粉 100 g，加水 500 mL,，浸泡 60
min,，超聲處理（250 W，50 Hz）60 min,，12 000 r/min
離心 10 min,，得上清液。分別將 A,、B 2 種衍生試
劑用乙腈稀釋至原來濃度的 1/5,，精密量取上清液 1
mL，置于試管中,，加入稀釋后的 A 溶液 0.5 mL 和
稀釋后的 B 溶液 0.5 mL,，渦旋混合 1 min，在 50 ℃
水浴中加熱 45 min,，取出,，加入正己烷溶液 1 mL，
振搖,，渦旋混合 1 min,，靜置 30 min，吸取下層澄
清液體,，用孔徑為 0.45 μm 有機濾膜濾過,，即得到
衍生化后的樣品溶液。
2.2 評價指標
2.2.1 凍干率[11] 凍干率是物料凍干后脫水質(zhì)量
占物料水分總量的比例,，本實驗采用費休氏水分測
定法測定樣品中的含水量從而計算出凍干率,。
凍干率＝1－含水量
2.2.2 指紋圖譜相似度分析[12-13]
（1）對照品溶液的制備：取 Welch 公司 17 種
氨基酸混合對照品溶液（原濃度）用水稀釋至原來
濃度的 1/10 作為對照品溶液。
（2）色譜條件：色譜柱為 Ultimate Amino Acid
AAA 氨基酸分析柱（250 mm×4.6 mm,，5 μm,，月
旭材料科技有限公司）；體積流量 1.0 mL/min,；柱溫
40 ℃,；進樣量 5 μL；檢測波長 254 nm,。流動相 A
為 0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（pH 6.5）-乙睛（93∶7）,；
流動相 B 為水-乙腈（20∶80），二元梯度洗脫,，洗
脫程序：0～11 min,，100%～93% A；11～13.9 min,，
93%～88% A,；13.9～14 min，88%～85% A,；14～
29 min,，85%～66% A；29～32 min,，66%～30% A,；
32～35 min，30%～0% A,；35～45 min,，0% A；45～
60 min,，100% A,。
（3）精密度試驗：取“2.1”項下衍生化后供試
品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進樣 6 次。將 6 次
測定圖譜轉(zhuǎn)化為 AIA 格式后依次導入相似度軟件,，
輸出 17 個共有峰峰面積的 RSD 為 0.12%～3.43%,，
保留時間的 RSD 為 0.04%～0.31%，表明儀器精密
度良好,。
（4）穩(wěn)定性試驗：取“2.1”項下制備的同 1 份
衍生化后供試品溶液,，在上述色譜條件下分別在 0、
2,、4,、6、8,、12,、24、48,、72 h 進樣,，進行測定。
測定圖譜轉(zhuǎn)化為 AIA 格式后依次導入相似度軟件,，
輸出 17 個共有峰峰面積的 RSD 為 0.17%～2.81%,，
·3168· 中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
保留時間的 RSD 為 0.03%～0.13%，表明樣品在 72
h 內(nèi)穩(wěn)定,。
（5）重復性試驗：取“2.1”項下平行制備的 6
份衍生化后供試品溶液,，按照上述色譜條件進行測
定。測定圖譜轉(zhuǎn)化為 AIA 格式后依次導入相似度軟
件,，輸出 17 個共有峰峰面積的 RSD 為 0.41%～
3.58%,，保留時間的 RSD 為 0.03%～0.15%，表明方
法的重復性良好,，證明分析方法和提取工藝的穩(wěn)定
性和可靠性,。
（6）共有圖譜的建立：取“2.1”項下的衍生化
后供試品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進樣 10 次,，
取對照品溶液,，按色譜條件項下條件進行測定并標
示，如圖 1 所示,，峰 1～17 為地龍氨基酸組分提取
物中含有的 17 種氨基酸成分,，分別為門冬氨酸、谷
氨酸,、絲氨酸,、甘氨酸、組氨酸,、精氨酸,、蘇氨酸,、
丙氨酸、脯氨酸,、胱氨酸,、纈氨酸、蛋氨酸,、異亮
氨酸,、亮氨酸,、酪氨酸,、苯丙氨酸、賴氨酸,。其中
峰 10（胱氨酸）在 HPLC 圖譜中分離良好,，質(zhì)量分
數(shù)較高且穩(wěn)定，所以選擇其為參照峰,，共標示了 17
個共有峰,。
1-門冬氨酸 2-谷氨酸 3-絲氨酸 4-甘氨酸 5-組氨酸 6-精氨酸 7-蘇氨酸 8-丙氨酸 9-脯氨酸 10-胱氨酸 11-纈氨酸 12-蛋氨酸
13-異亮氨酸 14-亮氨酸 15-酪氨酸 16-苯丙氨酸 17-賴氨酸
1-aspartic acid 2-glutamic acid 3-serine 4-glycine 5-histidine 6-arginine 7-threonine 8-alanine 9-proline 10-cystine acid 11-valine
12-methionine 13-isoleucine 14-leucine 15-tyrosine 16-phenylalanine 17-lysine
圖 1 地龍氨基酸組分提取物參照圖譜
Fig. 1 Reference fingerprint of extract components of amino acid in lumbricus
2.3 凍干工藝單因素試驗考察
2.3.1 共晶點（共融點）的測定及預(yù)凍溫度的確定
溶液裝入 10 mL 燒杯中，置于凍干機前箱,，插入共
晶點探頭及溫度探頭,，啟動共晶點測定儀,，設(shè)定凍
干機預(yù)凍溫度為−50 ℃，預(yù)凍 3 h，測定共晶點,。
按照凍干理論[7]，為保證物料*凍結(jié),，產(chǎn)品預(yù)凍
溫度一般應(yīng)選擇在共晶點溫度以下 5～15 ℃為宜,，
經(jīng)測定該制品溶液的共晶點為−16.5 ℃，共融點為
−17.9 ℃,，據(jù)此推測預(yù)冷凍溫度應(yīng)低于−26.5 ℃,，
為確保產(chǎn)品在預(yù)凍時*凍結(jié)，試驗選擇−26.5 ℃
為預(yù)凍溫度,。
2.3.2 預(yù)凍時間的確定 精密吸取地龍藥液,，在
−26.5 ℃下預(yù)凍，在−25 ℃進行升華干燥 16 h,，40
℃進行解析干燥6 h,，壓力維持在15 Pa左右[14]，
預(yù)凍時間分別設(shè)置為 2,、3,、4、5 h,，以凍干產(chǎn)品外
觀性狀和凍干率為指標考察不同預(yù)凍時間對產(chǎn)品質(zhì)
量的影響,，結(jié)果見表 1,。預(yù)凍時間僅 2 h 時，凍干產(chǎn)
品外觀收縮,，呈黃色團塊,，隨著預(yù)凍時間的延長，
產(chǎn)品的性狀良好,，質(zhì)地疏松,，在預(yù)凍時間為 4～5 h
時，凍干品的外觀及凍干率質(zhì)量,，因此確定預(yù)
凍時間為 4 h,。
2.3.3 升華干燥溫度對產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗
1
2
3
4
5
8
6
7 9
10
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14
15
16
17
0 5 10 15 20 25 30 35
t/min
中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月 ·3169·
表 1 預(yù)凍時間對產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 1 Effects of pre freezing time on product quality
預(yù)凍時間/h 性狀 凍干率/%
2 收縮，黃色團塊 50.00
3 略有鼓泡,，淡黃色塊狀物,，
質(zhì)地疏松
93.46
4 淡黃色塊狀物，質(zhì)地疏松 94.31
5 淡黃色塊狀物,，質(zhì)地疏松 94.33
升華干燥又稱第 1 階段干燥,，是指凍結(jié)產(chǎn)品中的冰
晶升華成水蒸氣逸出而使產(chǎn)品脫水干燥。當全部冰
晶除去時,，第 1 階段干燥完成,，此時除去全部水分
的 90%左右。升華時所需熱量由擱板供給,，產(chǎn)品在
干燥時期溫度必須低于其共融點的溫度,，同時考慮
到產(chǎn)能，因此在−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h,，壓
力維持在 15 Pa 左右,，40 ℃進行解析干燥 6 h 的條
件下，選擇升華干燥溫度−18,、−20,、−22、−24 ℃ 4
個水平進行單因素試驗,，結(jié)果見表 2,。升華階段擱
板溫度在低于共融點下，溫度越高,，產(chǎn)品的性狀良
好,，質(zhì)地疏松，顏色均勻,，產(chǎn)品凍干率提高,；溫度
越低，在同等升華干燥時間內(nèi),，產(chǎn)品外觀顏色深,，
凍干率明顯降低,，可能是產(chǎn)品干燥不充分，需要延
長升華干燥時間,，但是從能耗角度,，已經(jīng)不具備可
行性，因此確定升華干燥溫度−18,、−20,、−22 ℃作
為 Box-Behnken 設(shè)計實驗的 3 個水平。
表 2 升華干燥溫度對產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 2 Effects of sublimation drying temperature on
product quality
擱板溫度/℃ 性狀 凍干率/%
−18 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀,，顏色均勻 92.60
−20 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀,，顏色較均勻 96.01
−22 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀,，顏色均勻 94.18
−24 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀，中間顏色深 88.75
2.3.4 升化時間對產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗 在
升華干燥階段,，升華時間是很關(guān)鍵的因素,，時間太
短，擱板溫度很快達到預(yù)定的溫度,，使供給物料的
熱量也增加的過快,，導致超過物料的共融點溫度使
其融化。因此在確定−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h,，40
℃進行解析干燥 6 h,，暫定升華溫度為−20 ℃不變
的條件下，選擇以下 4 個時間段位因素進行考察,，
結(jié)果見表 3,。進入升華干燥階段，升華時間過短會
導致冰晶融化,，凍干率很低,，隨著升溫時間的延長，
產(chǎn)品性狀良好,，時間過長會加長凍干周期且消耗不
表 3 升華時間對產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 3 Effects of sublimation time on product quality
升華時間/h 性狀 凍干率/%
5 收縮,，顏色不均勻 33.00
6 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀,，顏色均勻 94.18
7 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀，顏色均勻 96.01
8 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀,，顏色均勻 95.60
必要的能量,，因此確定升華時間 6、7,、8 h 作為
Box-Behnken 設(shè)計實驗的 3 個水平,。
2.3.5 解析干燥溫度對產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗
為了使產(chǎn)品達到合格的殘余含水量，必須對產(chǎn)品進
一步干燥,，產(chǎn)品的熱量主要靠擱板供給,，所以在
−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h，−20 ℃進行升華干燥 7
h 不變的條件下,，選擇 20,、25、30,、35 ℃ 4 個溫
度進行單因素試驗,，結(jié)果見表 4。在解析干燥階段,，
隨著溫度的上升,，凍干*，當擱板溫度為 30
℃時,，凍干產(chǎn)品性狀良好,，骨架結(jié)構(gòu)完整，海綿狀,，
顏色均勻,，凍干效果已經(jīng)較好，隨著擱板溫度繼續(xù)
增高,，凍干率也不能增加,，且增加產(chǎn)能，因此確定
解析溫度 20,、25,、30 ℃作為 Box-Behnken 設(shè)計實
驗的 3 個水平。
表 4 解析干燥溫度對產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 4 Effects of analytical drying temperature on
product quality
擱板溫度/℃ 性狀 凍干率/%
20 質(zhì)地疏松,，黃色塊狀物,，中間顏色
稍深
93.08
25 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀,，顏色均勻 94.25
30 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.51
35 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀,，顏色均勻 95.48
2.3.6 解析干燥時間對產(chǎn)品質(zhì)量影響的單因素試驗
解析干燥時間同樣是影響凍干工藝樣品的參數(shù)之
一，因此在−26.5 ℃的溫度下預(yù)凍 4 h,，−20 ℃進行
升華干燥 7 h,，解析干燥溫度暫定為 30 ℃不變的條
件下,，選擇以下 4 個時間進行試驗，結(jié)果見表 5,。
在解析干燥階段,，隨著解析干燥時間的延長，凍干
*,，凍干周期也延長,，能耗越來越高，至解
析干燥 4 h 后,，再延長時間,，已基本無影響，因此
確定解析干燥時間 3.0,、3.5,、4.0 h 作為 Box-Behnken
設(shè)計實驗的水平。
2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗
2.4.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 通過預(yù)試驗和單因素試驗
·3170· 中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
表 5 解析干燥時間對產(chǎn)品質(zhì)量的影響
Table 5 Effects of analytical drying time on product quality
解析時間/h 性狀 凍干率/%
3.0 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀,，顏色均勻 95.06
3.5 質(zhì)地疏松，淡黃色塊狀,，顏色均勻 95.25
4.0 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀，顏色均勻 96.01
4.5 質(zhì)地疏松,，淡黃色塊狀，顏色均勻 95.94
的考察,，僅確定部分參數(shù),，其*工藝需進一步優(yōu)
選，本實驗選取升華干燥溫度（A）,、升華時間（B）,、
解析干燥溫度（C）、解析干燥時間（D）為考察因
素,，以凍干率為評價指標,，采用 Box-Behnken 響應(yīng)
面法對工藝進行優(yōu)化，考察各因素對產(chǎn)品質(zhì)量的綜
合影響,，試驗設(shè)計及結(jié)果見表 6,。方差分析見表 7。
2.4.2 回歸模型的建立及方差分析 采用 Design
表 6 地龍活性組分凍干工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果
Table 6 Design and experimental results of process of freeze-dried optimization of active components in lumbricus
試驗號
因素 凍干率/%
試驗號
因素 凍干率/%
A/℃ B/h C/℃ D/h 實測 預(yù)測 A/℃ B/h C/℃ D/h 實測 預(yù)測
1 −18 (1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 94.06 94.44 15 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 3.0 (−1) 91.28 91.67
2 −18 (1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 93.90 93.63 16 −20 (0) 6 (−1) 35 (1) 3.5 (0) 94.66 94.36
3 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 4.0 (1) 93.82 94.21 17 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.57 96.62
4 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.50 96.62 18 −20 (0) 7 (0) 30 (0) 3.5 (0) 96.79 96.62
5 −20 (0) 8 (1) 30 (0) 4.0 (1) 94.45 94.81 19 −20 (0) 6 (−1) 30 (0) 3.0 (−1) 90.58 91.01
6 −22 (−1) 6 (−1) 30 (0) 3.5 (0) 94.79 94.67 20 −22 (−1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 94.76 95.16
7 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 89.92 89.64 21 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 3.0 (−1) 90.66 90.37
8 −18 (1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 94.52 94.26 22 −22 (−1) 8 (1) 30 (0) 3.5 (0) 95.42 95.30
9 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 4.0 (1) 93.96 93.86 23 −18 (1) 7 (0) 35 (1) 3.5 (0) 91.12 91.82
10 −20 (0) 6 (−1) 25 (−1) 3.5 (0) 94.82 94.69 24 −20 (0) 7 (0) 25 (−1) 3.0 (−1) 90.82 90.69
11 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.96 93.84 25 −18 (1) 7 (0) 30 (0) 4.0 (1) 93.07 92.80
12 −20 (0) 7 (0) 35 (1) 4.0 (1) 93.79 93.54 26 −20 (0) 8 (1) 35 (1) 3.5 (0) 95.27 95.00
13 −20 (0) 8 (1) 25 (−1) 3.5 (0) 95.41 95.31 27 −22 (−1) 7 (0) 25 (−1) 3.5 (0) 93.10 93.18
14 −22 (−1) 7 (0) 30 (0) 3.0 (−1) 90.79 90.67
表 7 方差分析
Table 7 ANOVA regression analysis
方差來源 平方和 自由度 F 值 P 值 顯著性 方差來源 平方和 自由度 F 值 P 值 顯著性
A 3.23 1 17.71 0.001 2 ** A2 14.92 1 81.70 ＜0.000 1 **
B 1.19 1 6.52 0.025 3 * B2 1.25 1 6.84 0.022 6 *
C 0.30 1 1.66 0.221 3 C2 8.94 1 48.98 ＜0.000 1 **
D 30.08 1 164.75 ＜0.000 1 ** D2 55.00 1 301.20 ＜0.000 1 **
AB 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 殘差 2.19 12
AC 5.29 1 28.97 0.000 2 ** 失擬項 2.15 10 9.37 0.100 2
AD 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 純誤差 0.046 2
BC 1.00×10−4 1 5.48×10−4 0.981 7 總和 103.27 26
BD 1.23×10−3 1 6.71×10−3 0.936 1 變異系數(shù) 0.004 6
CD 2.50×10−5 1 1.37×10−4 0.990 9 校正決定系數(shù) 0.978 8
*
P＜0.05,，模型或考察因素有顯著影響,；**P＜0.01，模型或考察因素有極顯著影響
*
P < 0.05, model or investigation factor with significant effect; **P < 0.01, model or investigation factor with extremely significant effect
中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月 ·3171·
Expert 8.05 軟件,，分別對各因素水平進行多元線性
回歸和非線性回歸（二項式擬合）,，建立地龍活性組
分凍干率（Y）對 4 個因素（A,、B、C,、D）的 2 次
回歸模型方程為 Y＝96.62－0.52 A＋0.32 B－0.16
C＋1.58 D－0.002 5 AB－1.15 AC－0.005 AD＋
0.005 BC－0.017 BD－0.002 5 CD－1.67 A2－0.48
B2
－1.29 C2
－3.21 D2
,。
經(jīng)方差分析（表 7）得知，自變量 1 次項 B,，2
次項 B2顯著（P＜0.05）,，1 次項 A、D,，2 次項 AC,、
A2
、C2
,、D2極顯著（P＜0.01）,，表明模型具有統(tǒng)計
學意義。失擬項用來表示所用模型與實驗擬合的程
度,，即二者差異的程度,，本例 P 值為 0.100 2＞0.05，
對模型是有利的,，無失擬因素存在,。進一步，校正
決定系數(shù)（0.978 8＞0.80）和變異系數(shù)為 0.46%,，
說明該模型只有 2.12%的變異,，表明該模型擬合優(yōu)
度較好，可用該模型及回歸方程代替試驗真實點對
實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測（預(yù)測結(jié)果見表 6）,。
2.4.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗證 各因素之間的
響應(yīng)面圖和等高線圖見圖 2,，由 Design Expert 8.05
軟件分析得響應(yīng)面值zui大時，A,、B,、C、D 對應(yīng)的
編碼值分別為 0,、0,、0、0,，與之對應(yīng)的地龍活性組
分*凍干工藝條件為升華干燥溫度−20 ℃,、升華
圖 2 Y 與 4 因素的三維效應(yīng)面圖和等高線圖
Fig. 2 3D Response surface plots and contour plots of Y and four factors
97
Y/%
B/h A/℃
B/h
A/℃ A/℃
Y/%
Y/%
Y/% Y/%
Y/%
Y/%
B/h C/℃
C/℃ D/h
C/℃ D/h D/h
−21 A/℃ −19
6.5 B/h 7.5 27 C/℃ 33
B/h
C/
℃
D/h
C/
℃
D/h
D/h
95
93
7.5
6.5
−19
−21
97
94
91
33
27
−19
−21
90
94
98
3.2
3.8
−21
−19
97
96
95
94
33
27
7.5
6.5
97
94
91
3.2
3.8
6.5
7.5
91
94
97
3.8
3.2
33
27
7.5
6.5 27
33
3.2
3.8
−21 A/℃ −19 −21 A/℃ −19
Y/% Y/%
27
33
3.2
3.8 3.8
3.2
6.5 B/h 7.5
Y/% Y/% Y/%
·3172· 中草藥 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 21 期 2015 年 11 月
時間 7 h、解析干燥溫度 30 ℃,、解析干燥時間 3.5 h,，
此時凍干率的理論值達 96.62%。
2.5 驗證試驗
為檢驗單因素及響應(yīng)面預(yù)測的可靠性，選擇zui
佳凍干工藝條件（預(yù)凍溫度−26.5 ℃,，預(yù)凍 4 h,，升
華干燥溫度−20 ℃、升華時間 7 h,、解析干燥溫度
30 ℃,、解析干燥時間 3.5 h）進行 3 批放大工藝驗
證試驗，測定凍干率,，并為確認本工藝不影響地龍
氨基酸組分的活性,，將驗證批樣品與對照藥材的氨
基酸指紋圖譜進行相似性分析，判斷是否zui大程度
保留其活性組分的有效性[2-3],。
結(jié) 果 3 批樣品的凍干率分別為 96.59% ,、
96.45%、96.61%,，指紋圖譜相似度分別為 0.912,、
0.905、0.915,。采用*凍干工藝條件得到的地龍
提取物顏色均勻,，性狀良好，測得凍干率在 96.55%,，
與預(yù)測值 96.62%基本吻合,，說明響應(yīng)面法優(yōu)化的凍
干工藝條件穩(wěn)定，與對照藥材的氨基酸指紋圖譜相
似度均大于 0.9,，表明該工藝具備可行性,。
3 討論
動物藥活性成分以多肽和蛋白質(zhì)為主，地龍中
含量zui為豐富的物質(zhì)即為蛋白質(zhì),，但其主要成分氨
基酸類具有水溶性和對熱不穩(wěn)定的性質(zhì),，因此對提
取后活性成分處理和保存是非常關(guān)鍵的。本實驗采
用冷凍干燥技術(shù),，應(yīng)用單因素及 Box-Behnken 響應(yīng)
面設(shè)計方法，對其活性組分凍干工藝進行優(yōu)化,。結(jié)
果表明,，此優(yōu)化方法在保證獲得較好凍干率的基礎(chǔ)
上，能夠zui大程度地保留地龍?zhí)崛∥镉行С煞值幕?br />性,，工藝穩(wěn)定可行,，為地龍制劑研究及臨床應(yīng)用提
供一定的實驗基礎(chǔ)。
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