NANOLAB  3D Gel™即用型 3D細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠

產(chǎn)品介紹：

即用型 3D 細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠

產(chǎn)品描述和規(guī)格

3D Gel™ 為無(wú)動(dòng)物源性多糖水凝膠體系,，模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 環(huán)境,。水凝膠為即用型中性 pH 溶液，室溫即可穩(wěn)定保存,。使用時(shí),，只需與細(xì)

胞培養(yǎng)基混合即可形成水凝膠基質(zhì)。水凝膠顏色透明,，具有可滲透性,，相容 于多種細(xì)胞成像系統(tǒng)。培養(yǎng)在水凝膠系統(tǒng)的細(xì)胞可在試驗(yàn)后輕松收獲,，水凝 膠也可注射,，非常適合體內(nèi)研究。3D Gel 為細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)具功能性且優(yōu) 化的環(huán)境,，讓細(xì)胞感覺(jué)在家一樣,。從 2D 凝膠培養(yǎng)，3D 細(xì)胞培養(yǎng)到動(dòng)物注射,， 3D Gel 提供一個(gè)可以同時(shí)適用于體外研究與活體實(shí)驗(yàn)的共通操作平臺(tái),。 TheWell 有兩種水凝膠系統(tǒng)：

3D Gel – 適用于懸浮細(xì)胞系

3D Gel-RGD（RGD 肽修飾的 3D Gel）– 適用于貼壁細(xì)胞

應(yīng)用說(shuō)明：

產(chǎn)品：          3D Gel (Cat#: NANO001)

                3DGel-RGD (Cat#: NANO002)

僅供科研用途，不得用于診斷過(guò)程,。

3D細(xì)胞培養(yǎng)

（可注射水凝膠制備）

材料：

3D Gel,，細(xì)胞培養(yǎng)基，微量移液器或注射器,，細(xì)胞培養(yǎng)孔板,，細(xì)胞， 37 ?C 水浴

方法：

1.     在 37?C 預(yù)熱 3D Gel 溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基,。

2. 向 4mL 3D Gel 溶液中加入 1mL 細(xì)胞懸液，使用微量移液器（或 快速渦旋振蕩）輕輕混勻,，盡量不要產(chǎn)生氣泡,。（對(duì)于水凝膠注射：混合 物可轉(zhuǎn)移到注射器，水凝膠在穩(wěn)定 15-30 分鐘后即可用于注射,。）

3.     將水凝膠混合液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)孔板,。

注：傾斜/旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以確保水凝膠在培養(yǎng)板上包被均勻,。

不同細(xì)胞板的推薦體積如下表：

4.     等待 15 分鐘至水凝膠穩(wěn)定,。

5.     小心加入細(xì)胞培養(yǎng)基以覆蓋水凝膠溶液。

6.    將細(xì)胞培養(yǎng)板加入培養(yǎng)箱,，每 48 小時(shí)換液

注：

l       預(yù)熱 3D Gel 溶液有助于降低溶液粘度,。

l       終細(xì)胞濃度可根據(jù)不同細(xì)胞類(lèi)型調(diào)整。我們推薦 2×105 to 1×106,。

2D 凝膠培養(yǎng)                                                                                                              

材料：

3D Gel,，細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS,，微量移液器，細(xì)胞培養(yǎng)孔板,，細(xì)胞,，37 ?C 水浴

方法：

1.     在 37 ?C 預(yù)熱 3D Gel 溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.     向 4mL VitroGel  3D 溶液中加入 1mL 細(xì)胞培養(yǎng)基(或 PBS),，使用微量 移液器（或快速渦旋振蕩）輕輕混勻,，盡量不要產(chǎn)生氣泡。

3.     將水凝膠混合液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)孔板,。

注：傾斜/旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板,，以確保水凝膠在培養(yǎng)板上包被均勻。

4.     等待 15 分鐘至水凝膠穩(wěn)定,。

5.     吸出多余液體,，小心將細(xì)胞加到水凝膠頂部。

6.     將細(xì)胞培養(yǎng)板加入培養(yǎng)箱,，每 48 小時(shí)換液,。

注：

l       預(yù)熱 3D Gel 溶液有助于降低溶液粘度。

l       終細(xì)胞濃度可根據(jù)不同細(xì)胞類(lèi)型調(diào)整,。

NANOLAB  3D Gel™即用型 3D細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠

初次使用說(shuō)明

（請(qǐng)?jiān)谑褂卯a(chǎn)品前仔細(xì)閱讀）

請(qǐng)根據(jù)不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)基組分優(yōu)化 VitroGel  3D 水凝膠系統(tǒng),，以得到更

好的結(jié)果。初次使用用戶,，強(qiáng)烈建議培養(yǎng)不同的細(xì)胞系時(shí),，都進(jìn)行水凝膠濃 度梯度測(cè)試。

請(qǐng)參照以下步驟設(shè)置水凝膠濃度梯度：

1.     稀釋?zhuān)?/strong>可通過(guò)稀釋水凝膠溶液調(diào)節(jié)終水凝膠強(qiáng)度：直接將水凝膠溶液 與去離子水或 0.1X PBS（不含鈣或鎂離子）以 1:0-1:5（水凝膠溶液： 去離子水,，v/v）室溫混合,。（終膠強(qiáng)度 1:0 > 1:1 > 1:2 > 1:3 > 1:4 > 1:5）

2.     成膠：稀釋的水凝膠溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基不同的混合比例會(huì)影響成膠速度 及終的膠強(qiáng)度。推薦的混合比例為 4:1-1:3（稀釋的水凝膠：細(xì)胞培養(yǎng) 基,，  v/v）,。

l       相同稀釋度的水凝膠溶液，添加越多細(xì)胞培養(yǎng)基,，成膠越快,。 對(duì)于稀釋度較高的水凝膠溶液（eg. 1:3, 1:4 or 1:5），請(qǐng)使用較多 的細(xì)胞培養(yǎng)液混合,，以確保水凝膠在合理的時(shí)間內(nèi)成膠,。

l       不同細(xì)胞培養(yǎng)基的推薦混合比例，請(qǐng)參考下表,。

活/死細(xì)胞分析                                                                                        

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞,，活/死細(xì)胞染色液，PBS，微量移液器,， 熒光顯微鏡

方法：

1.     移去覆蓋于水凝膠之上的細(xì)胞培養(yǎng)基,，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

2.     用 PBS 制備 5X 活/死細(xì)胞染色溶液

3.     將活/死細(xì)胞染色溶液直接加入到水凝膠中并淹沒(méi)整個(gè)凝膠,。推薦體積如 下表：

4.     在黑暗中孵育 5 分鐘,，在熒光顯微鏡下觀察。

注：

l    推薦使用 5X 染色液作為起始濃度,?？苫诓煌?xì)胞系和成像系統(tǒng)優(yōu)化 更佳濃度。

l    細(xì)胞染色后應(yīng)盡快分析

細(xì)胞收獲：

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞,，0.1XPBS 或去離子水,，離心管，微量移

液器,，37?C 水浴,，漩渦震蕩儀

方法：(使用 24 孔板，250μL 膠/孔為例)

1.     在 37℃水浴預(yù)熱 0.1X PBS(或去離子水)及空的離心管,。

2.     由培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)板,，棄掉覆蓋于水凝膠頂部的培養(yǎng)基。

3.     每孔加入 1 mL 預(yù)熱的 0.1X PBS,，并上下吹打以*混勻,。

4.     將混合物加入預(yù)熱的離心管。

5.     用 1 mL 預(yù)熱的 0.1X PBS 潤(rùn)洗每個(gè)孔,，并加入離心管中,。

6.     上下吹打，充分混勻,，并加入預(yù)熱的 0.1X PBS 至 10mL,。

7.     將離心管漩渦震蕩 5-10 秒，并在 37℃水浴放置 1-5 分鐘（可選）,。

8.     1,000 rpm 離心 2-5 分鐘,，棄上清，收集細(xì)胞沉淀,。

9.     用預(yù)熱的 0.1X PBS 重懸細(xì)胞，如果需要可重復(fù) 6-8 步驟一次(可選),。

注：

l       使用預(yù)熱的 0.1X  PBS 或去離子水,，不要使用冷的溶液或 1X PBS（或 高離子濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基）。

l       根據(jù)不同細(xì)胞系優(yōu)化離心的速度和時(shí)間,。

熒光染色：

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞,，PBS，微量移液器,，固定液（4％甲醛 PBS 溶液）,，滲透液（0.1% Triton X-100 PBS 溶液）,，肌動(dòng)蛋白抑制劑染色液，細(xì) 胞核染色液,，微量移液管,，熒光顯微鏡。

方法：

1.     移去覆蓋于水凝膠之上的細(xì)胞培養(yǎng)基,，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次,。

2.     將固定液加入水凝膠中，并在室溫孵育 30 分鐘,。

3.     棄去固定液,，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

4.     加入滲透液并淹沒(méi)整個(gè)凝膠,，置于室溫 5 分鐘,。

5.     棄去滲透液，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次,。

6.     加入肌動(dòng)蛋白抑制劑染色液,，室溫，黑暗孵育 1 小時(shí),。

7.   棄去肌動(dòng)蛋白抑制劑染色液,，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

8.     加入細(xì)胞核染色液,，室溫,，黑暗孵育 5 分鐘。

9.     棄去細(xì)胞核染色液,， 并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次,。

10.   熒光顯微鏡下觀察。

注：

l       根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明配制染色液,?？筛鶕?jù)不同細(xì)胞系和水凝膠調(diào)節(jié)染色液 終濃度。

l       在清洗步驟中,，小心添加或移除溶液,，以避免損失水凝膠/細(xì)胞。

l       孵育時(shí)間可根據(jù)不同細(xì)胞系調(diào)整,。

l       水凝膠加入染色液后,，應(yīng)避免光照。

l       確保 PBS 沖洗步驟*,，同時(shí)水凝膠在整個(gè)過(guò)程中都需要溶液覆蓋,。

組織學(xué)分析：

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞，PBS，卡夾,，石蠟,，二甲苯，固定液（10％ 福爾馬林）,，乙醇（50-100％）

方法：

1.     移去覆蓋于水凝膠之上的細(xì)胞培養(yǎng)基,，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次

2.     將固定液加入水凝膠中，并在室溫孵育 30 分鐘,。

3.     棄去固定液,，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

4.     將水凝膠放于卡夾中,，用乙醇,，按照以下順序脫水：

50％（10 分鐘） - 70％（10 分鐘） - 80％（10 分鐘） - 95％（10 分鐘） - 100％（10 分鐘） - 100％（10 分鐘） - 100％（10  分鐘）。

5.     將乙醇換為二甲苯,，按照以下順序脫水：

65％乙醇：35％二甲苯（10-15 分鐘）-50％乙醇+50％二甲苯（10-15 分鐘）- 35％乙醇+65％二甲苯（10-15 分鐘） - 100％二甲苯（10-15 分鐘） - 100％二甲苯（10-15 分鐘） - 100％二甲苯（10 分鐘）

6.     將二甲苯換為石蠟,，按照以下順序：

65％二甲苯+35％石蠟(30  分鐘)  -  50％二甲苯+50％石蠟(30 分鐘) -

35％二甲苯+65％石蠟(30 分鐘) - * 石蠟 (1-2 小時(shí)) - * 石 蠟(1-2 小時(shí)或過(guò)夜)

7.     嵌入新鮮的石蠟中后，切片,，放于顯微鏡載玻片上,。

8.     根據(jù)不同的應(yīng)用進(jìn)行染色和組裝。

注：

l    根據(jù)不同細(xì)胞系和水凝膠大小優(yōu)化孵育時(shí)間,。確保水凝膠在整個(gè)過(guò)程中 都被溶液覆蓋,。

表 B：不同細(xì)胞的推薦稀釋比例和混合比例