化工儀器網(wǎng)
技術文章
樣本標記/追蹤與質(zhì)控在大規(guī)模新一代測序 項目中的必要性與技術方案
閱讀：3210 發(fā)布時間：2017-8-31
必要性：
隨著醫(yī)學項目在*范圍內(nèi)的不斷開展,，基于新一代測序（NGS）技術的大規(guī)?；蚪M數(shù)據(jù)采集已經(jīng)成為重要的研究手段之一。在此基礎上建立起來的大數(shù)據(jù)平臺,，輔以,、全面的健康和醫(yī)學數(shù)據(jù)，將為疾病的診斷與治療,，藥物的研發(fā)與個體用藥,，人群的健康保障等臨床與轉化醫(yī)學研究帶來極大的推動。
在大規(guī)模人群中開展NGS測序工作時,，樣本的準確性,、可溯源性將會對zui終的大數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生不可忽視的影響。由于NGS測序流程的復雜性（參見下圖,，NGS測序工作經(jīng)典流程）,，在樣本庫內(nèi)得到準確標記的樣本,，在測序流程中仍然有一定幾率會發(fā)生混淆或者污染。根據(jù)上大型測序中心的估算,，隨著測序樣本量的增加,，一個操作流程完善、工作人員受過專業(yè)培訓的基因檢測實驗室,，仍然有可能產(chǎn)生千分之一左右的樣本偏差,。
因此，一種準確有效卻又成本低廉的樣本標記與追蹤手段,，在大規(guī)模NGS測序工作中具有重要的現(xiàn)實意義。在美國ACMG（美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學院）發(fā)布的“臨床實驗室NGS測序標準”中指明：“相關實驗室必須采取措施,，避免樣本混淆,，并能夠隨時追蹤與確認zui終結果”。2017年3月,，中華醫(yī)學會病理學分會發(fā)布的“臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識”中進一步闡明：“為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染,，可選用多個SNV位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定,，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤,，證明沒有交叉污染”。
同時,，一個大型測序數(shù)據(jù)庫中面臨的樣本種類較為繁雜,，其中與腫瘤相關的樣本類型如石蠟包埋切片（FFPE）中提取的DNA、血漿中提取的循環(huán)腫瘤DNA等,，均在正確標記,、追蹤之外，還需在NGS文庫制備之前,，對其中DNA片段降解程度進行有效評估,，從而防止質(zhì)量較差的樣本帶來的測序成本損失。
技術方案：
樣本標記與跟蹤目前的主要方案,，是從待測序列（全基因組,、全外顯子組、靶向片段等）中選擇若干標志性單堿基核苷酸變異（SNV）,，在樣本入庫及測序前,，進行基于這些位點的等位基因分型，從而確保樣本的收集與使用流程中沒有發(fā)生混淆,。在測序完成后,，再次利用之前這些位點的基因數(shù)據(jù)，與測序結果進行再次驗證比對,，如果信息一致,，即可確認樣本正確性,，以及測序覆蓋范圍與數(shù)據(jù)質(zhì)量均達到標準。
為達到足夠的區(qū)分效果,，SNV需要滿足以下兩點標準：1）在待檢測人群（中國人群）中具有較高的雜合度與區(qū)分力,；2）需達到一定數(shù)量（30-40個）以在大規(guī)模樣本庫中仍可區(qū)分所有個體樣本。根據(jù)這兩點標準,，國內(nèi)外*人類基因組測序中心Broad Institute與華大基因均采用了美國Agena Bioscience公司基于核酸質(zhì)譜MassARRAY®開發(fā)的樣本標記/追蹤技術,。
該技術是利用MassARRAY®可以在一個反應中完成40多重SNV分型的特點，根據(jù)不同測序項目目標片段,，選擇約40個SNV位點（包括性染色體標記位點,，用于追蹤樣本性別信息），并加入用于樣本降解程度評估的片段完整性內(nèi)參標記,，在同一次反應中,，同時完成對樣本的標記與質(zhì)控，隨后以報告軟件自動生成檢測結果,，并整合進入樣本庫相關數(shù)據(jù),。
根據(jù)樣本庫與數(shù)據(jù)庫規(guī)模，MassARRAY®平臺可采用384格式,。在一天內(nèi),，該平臺可完成對6張384孔芯片（即2304個樣本）的標記/追蹤與質(zhì)控。
利用MassARRAY®強大的定制功能,，對不同的測序項目可以選取不同的SNV位點,，整合為新的檢測組合，因此具有更高的靈活性與針對性,。
隨著醫(yī)學項目在*范圍內(nèi)的不斷開展,，基于新一代測序（NGS）技術的大規(guī)?；蚪M數(shù)據(jù)采集已經(jīng)成為重要的研究手段之一。在此基礎上建立起來的大數(shù)據(jù)平臺,，輔以,、全面的健康和醫(yī)學數(shù)據(jù)，將為疾病的診斷與治療,，藥物的研發(fā)與個體用藥,，人群的健康保障等臨床與轉化醫(yī)學研究帶來極大的推動。
在大規(guī)模人群中開展NGS測序工作時,，樣本的準確性,、可溯源性將會對zui終的大數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生不可忽視的影響。由于NGS測序流程的復雜性（參見下圖,，NGS測序工作經(jīng)典流程）,，在樣本庫內(nèi)得到準確標記的樣本,，在測序流程中仍然有一定幾率會發(fā)生混淆或者污染。根據(jù)上大型測序中心的估算,，隨著測序樣本量的增加,，一個操作流程完善、工作人員受過專業(yè)培訓的基因檢測實驗室,，仍然有可能產(chǎn)生千分之一左右的樣本偏差,。
因此，一種準確有效卻又成本低廉的樣本標記與追蹤手段,，在大規(guī)模NGS測序工作中具有重要的現(xiàn)實意義。在美國ACMG（美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學院）發(fā)布的“臨床實驗室NGS測序標準”中指明：“相關實驗室必須采取措施,，避免樣本混淆,，并能夠隨時追蹤與確認zui終結果”。2017年3月,，中華醫(yī)學會病理學分會發(fā)布的“臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識”中進一步闡明：“為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染,，可選用多個SNV位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定,，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤,，證明沒有交叉污染”。
同時,，一個大型測序數(shù)據(jù)庫中面臨的樣本種類較為繁雜,，其中與腫瘤相關的樣本類型如石蠟包埋切片（FFPE）中提取的DNA、血漿中提取的循環(huán)腫瘤DNA等,，均在正確標記,、追蹤之外，還需在NGS文庫制備之前,，對其中DNA片段降解程度進行有效評估,，從而防止質(zhì)量較差的樣本帶來的測序成本損失。
技術方案：
樣本標記與跟蹤目前的主要方案,，是從待測序列（全基因組,、全外顯子組、靶向片段等）中選擇若干標志性單堿基核苷酸變異（SNV）,，在樣本入庫及測序前,，進行基于這些位點的等位基因分型，從而確保樣本的收集與使用流程中沒有發(fā)生混淆,。在測序完成后,，再次利用之前這些位點的基因數(shù)據(jù)，與測序結果進行再次驗證比對,，如果信息一致,，即可確認樣本正確性,，以及測序覆蓋范圍與數(shù)據(jù)質(zhì)量均達到標準。
為達到足夠的區(qū)分效果,，SNV需要滿足以下兩點標準：1）在待檢測人群（中國人群）中具有較高的雜合度與區(qū)分力,；2）需達到一定數(shù)量（30-40個）以在大規(guī)模樣本庫中仍可區(qū)分所有個體樣本。根據(jù)這兩點標準,，國內(nèi)外*人類基因組測序中心Broad Institute與華大基因均采用了美國Agena Bioscience公司基于核酸質(zhì)譜MassARRAY®開發(fā)的樣本標記/追蹤技術,。
該技術是利用MassARRAY®可以在一個反應中完成40多重SNV分型的特點，根據(jù)不同測序項目目標片段,，選擇約40個SNV位點（包括性染色體標記位點,，用于追蹤樣本性別信息），并加入用于樣本降解程度評估的片段完整性內(nèi)參標記,，在同一次反應中,，同時完成對樣本的標記與質(zhì)控，隨后以報告軟件自動生成檢測結果,，并整合進入樣本庫相關數(shù)據(jù),。
根據(jù)樣本庫與數(shù)據(jù)庫規(guī)模，MassARRAY®平臺可采用384格式,。在一天內(nèi),，該平臺可完成對6張384孔芯片（即2304個樣本）的標記/追蹤與質(zhì)控。
利用MassARRAY®強大的定制功能,，對不同的測序項目可以選取不同的SNV位點,，整合為新的檢測組合，因此具有更高的靈活性與針對性,。