事實上,，分光光度計的設計原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和度,。如EppendorfBiophotometer的準確度≤1.0%(1A),。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的,。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高,，也會導致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對較小,，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高(超過光度計的測試范圍),。后是操作因素，如混合要充分,，否則吸光值太低,，甚出現(xiàn)負值;混合液不能存在氣泡，液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試液和樣品,，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm,。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA),。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品，A320一般是0,。
蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白。選擇Warburg公式,，光度計可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,，先測試液，然后直接測試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息,，設定此功能“開”,。與測試核酸類似，要求A280的吸光值少大于0.1A,，佳的線性范圍在1.0-1.5之間,。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個正常的現(xiàn)象,。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù),，只要吸光值有少許改變,，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定,。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾;另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物,，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構成成分：氨基酸(如酪氨酸,，絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關,，從而反應蛋白質(zhì)濃度,。
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