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ELISA實(shí)驗(yàn)中對所使用的酶也有所要求,，主要為純度高,、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高,、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富,、價格便宜,、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，與抗體或抗原偶聯(lián)后需繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力,。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶,。此外，酶的底物應(yīng)易于制備和保存,，價格低廉,，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收度高,。ELISA中常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）,。

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜,。它是一種糖蛋白,，含糖量約18％，分子量為 44kD,，是一種復(fù)合酶,，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白,，在275nm 波長處有最高吸收峰,；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm 波長處有最高吸收峰,。

HRP的純度用RZ（ReinheitZahl,，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,，高純度的 HRP的 RZ≥3.0,。應(yīng)注意的是酶變性后，RZ 可不變但活力降低,，故選用酶制劑時更重要的指標(biāo)為活力,。酶活力以單位表示：1 min 將1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個單位。HRP催化反應(yīng)：DH2 + H2O2—— D +2H2O,。

OPD是在ELISA中應(yīng)用最多的底物,，靈敏度高，比色方便,。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差,，而且有潛在的致癌作用，使用時應(yīng)注意防護(hù),。而TMB無此缺點(diǎn),，TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍(lán)色,，目測對比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色,，可在比色計中定量；因此應(yīng)用日見增多,。

ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB,，但空白值很低。在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶,。從大腸桿菌提取的AP分子量為 80kD,，酶作用的最適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD,，最適pH為9.6,。一般采用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物,。它可制成片狀試劑,，使用方便。

產(chǎn)物為黃色的對硝基酚,，在405nm 有吸收峰,。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時間,。在ELISA中應(yīng)AP系統(tǒng),，其敏感性一般高 HRP系統(tǒng)，空白值也較低,。但由于獲得高純度AP較難,，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高,，且制備酶結(jié)合物時得率較HRP低等原因,，在ELISA中一般較多采用HRP。

除HRP和AP以外,，可應(yīng)用于ELISA試劑中的酶還有葡萄糖氧化酶,、β-半乳糖苷酶和脲酶等。如β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside）,，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone）,，可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度,。AP也可使用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物,。其缺點(diǎn)是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器,，此載體不可發(fā)出熒光,。