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本試劑盒根據(jù)鳥類多瘤病毒（Avian Polyoma Virus，APV）基因中的保守區(qū)設計引物，并對檢測體系進行了針對性優(yōu)化，可針對鳥類羽毛,、血液、組織及口腔/泄殖腔拭子等樣品中APV 的特異核酸片段進行PCR擴增,，擴增產(chǎn)物可以直接進行瓊脂糖凝膠電泳,，以進行結果判定。

實驗操作：

1. 樣本制備（樣本制備區(qū)）

請參照動物基因組DNA快速提取試劑盒（PCR分析用）說明書,，或其他符合相關標準的核酸提取試劑盒/方法,，對處理后的樣本進行核酸提取。提取的樣本核酸盡量及時進行檢測,，放置于冰盒中，否則于 4℃或-20℃保存,。

 

2. 配制反應體系（加樣區(qū)）

•  按照樣本數(shù)量（n+2,，n為樣本數(shù)，每次實驗建議設置 1 個陽性對照,，1 個陰性對照）配制反應液,，具體配制方法如下：分別吸取（（n+2）*7.5µL無酶無菌水+（n+2）*10µL APV反應液+（n+2）*1µL APV引物Mix）加入潔凈離心管中,，充分吹吸混勻,，分裝至0.2mL PCR 管（離心管）中，每孔18µL（如樣本過多,，可提前預制,，于 2~8℃短暫保存，2 小時內使用）

 

• 向反應液中依次添加 2μL無酶無菌水（陰性對照）,、樣本核酸和APV陽性對照,，蓋好 管蓋，做好記錄,，反應總體積為 20μL,。充分混勻,，離心 30 秒后進行PCR擴增實驗。

 

3. PCR擴增（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）

95℃預變性 5 分鐘,；94℃變性 45 秒,，55℃退火 45 秒，72℃延伸 45 秒,，共 35 個循環(huán),；72℃ 延伸 5 分鐘；4℃保存,。擴增產(chǎn)物先放置于 4℃（-20℃約 5 分鐘）條件下充分冷卻（15 分鐘）

4. 瓊脂糖凝膠電泳（以水平電泳瓊脂糖凝膠制備為例）

• 根據(jù)制膠量及凝膠濃度（1%~1.5%）,，量取一定量的電泳緩沖液，倒入三角錐形瓶中,。

注：制膠緩沖液和電泳緩沖液需一致,。

 

• 準確稱量瓊脂糖，小心加入三角錐形瓶中,。在錐形瓶的瓶口蓋上牛皮紙或封口膜,，置

于微波爐中或電磁爐上加熱溶解。加熱至溶液沸騰后,，請戴上防熱手套,，小心晃動錐形瓶，如 此重復數(shù)次,，直至瓊脂糖溶解,。

注：瓊脂糖溶解過程采用多次短暫沸騰的方法，避免溶液過熱暴沸,。保證瓊脂糖充分溶解,，以免造成電泳圖像模糊不清。

 

• 充分溶解的瓊脂糖稍冷卻后,，加入適量核酸染料,，輕微充分搖勻（避免產(chǎn)生大量氣泡）。

 

• 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中,，在適當位置處插上梳子,。凝膠厚度一般在 3~5mm之間。

 

•  室溫下待膠凝固（大約 30 分鐘~1 小時）,，小心拔出梳子,，將凝膠置于事前加入電泳緩沖液的電泳槽中，保證電泳緩沖液沒過凝膠,。

 

•  取 5μL DNA Marker以及 10μL經(jīng)瞬時離心冷卻后的擴增產(chǎn)物,，分別加入凝膠的各個點樣孔中，所有樣本點樣完成后,，靜置 2 分鐘后,，接通電泳槽電源,，根據(jù)實際情況設置電壓（70~120V）及電泳時間（20-30 分鐘）。

 

5. 結果判定

• APV陽性對照在 200bp左右出現(xiàn)擴增條帶,，且陰性對照無目標擴增條帶,，則結果成立。

•  樣本檢測結果在 200bp左右出現(xiàn)一條擴增主條帶,，表明待檢樣本中存在APV核酸,，則

判定為APV陽性。

• 樣本檢測結果無目標擴增條帶,，表明樣本中未檢測出APV核酸,，則判定為APV陰性。