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我打算做一個(gè)RNA-seq項(xiàng)目,，研究一株細(xì)菌在兩個(gè)環(huán)境條件下的表達(dá)差異。現(xiàn)在,，我打算確定生物學(xué)重復(fù)的個(gè)數(shù),，以便可以得到統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的結(jié)果。我打算每個(gè)環(huán)境的樣本設(shè)置兩個(gè)生物學(xué)重復(fù),，而不打算測更多重復(fù),。請問，兩個(gè)重復(fù)的設(shè)置是否合理,？

1.如果是我的話,，我會(huì)選擇設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。要知道兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)意味著雙倍的工作量但沒有雙倍的效果,。如果做兩個(gè)生物學(xué)重復(fù),，你會(huì)引入無法校正的噪音。如果兩個(gè)重復(fù)結(jié)果一樣,，那能說明問題,，但如果不一樣，你就解釋不了了,。如果樣品制備不是非常難,，經(jīng)費(fèi)不是非常有限，我建議還是設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)吧{:4_239:}

2.這是個(gè)有意思的問題,，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來說
排除生物學(xué)意義,，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來說,，不同的統(tǒng)計(jì)方法,，對生物學(xué)重復(fù)的個(gè)數(shù)的要求并不相同。
如果使用T檢驗(yàn),，你應(yīng)該設(shè)置盡可能多的生物學(xué)重復(fù),，建議至少3個(gè)重復(fù)。當(dāng)然T檢驗(yàn)的方法，在RNA-seq的差異分析里不是很合理,。因?yàn)镽NA-seq的誤差分布,，并不符合正態(tài)分布。
如果你選擇的統(tǒng)計(jì)模型是Fisher 檢驗(yàn)類的統(tǒng)計(jì)模型（包括超幾何分布或泊松分布）,，即使沒有生物重復(fù)也是可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的,。當(dāng)然，沒有生物學(xué)重復(fù)只是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上可行,，但實(shí)際上無算估算生物差異或?qū)嶒?yàn)誤差帶來的系統(tǒng)誤差,。所以，這樣的策略現(xiàn)在發(fā)表論文的話,，可能會(huì)被質(zhì)疑的,。
如果你選擇一些軟件，例如Deseq這樣的軟件,，一般也要求2個(gè)以上的生物學(xué)重復(fù),。

這個(gè)是非常有意思的問題，我提供的建議非常有限,，期望其他人有更好的回答,。

1.  

“虎式坦克”的回答不錯(cuò)。關(guān)于生物學(xué)重復(fù)與統(tǒng)計(jì)的關(guān)系,，我補(bǔ)充一下,。在我們的測序樣本中，每一個(gè)基因表達(dá)量的方差包含兩個(gè)方面的內(nèi)容：
1）處理方差,，就是我們的實(shí)驗(yàn)處理導(dǎo)致的差異,，這些差異當(dāng)然就是我們關(guān)注的；
2）誤差方差,，就是與我們實(shí)驗(yàn)處理無關(guān)的差異,，例如，生物個(gè)體間的差異,，實(shí)驗(yàn)技術(shù)不穩(wěn)定導(dǎo)致的偏差等,。誤差方差并非我們關(guān)注的，但這些差異會(huì)引入假陽性,。

所以生物學(xué)重復(fù)的價(jià)值在于幫助我們估算誤差方差的大小,，從而我們可以從總體方差中剔除誤差方差的影響。

以上的內(nèi)容,，就是生物統(tǒng)計(jì)學(xué)中“方差分析”所講的內(nèi)容,。其實(shí)RNA-seq差異分析的主體思路和方差分析基本相同，只是把誤差分布的假設(shè)從方差分析的正態(tài)分布,，替換為了其他更合理的分布,，例如負(fù)二項(xiàng)分布,。 那么，生物學(xué)重復(fù)在這里的意義就是用于計(jì)算誤差方差的大小,。因?yàn)樯飳W(xué)重復(fù)間不存在處理效應(yīng),，任何差異都屬于誤差方差的范疇。

但還需要補(bǔ)充一點(diǎn),，由于我們大部分二代測序只有2~3個(gè)生物學(xué)重復(fù),。這么少的重復(fù)數(shù)，正確預(yù)估每個(gè)基因誤差方差其實(shí)是不夠的（也就是單個(gè)基因的方差估計(jì)很不穩(wěn)定）,。所以,，一般的差異表達(dá)分析軟件（例如，Deseq,，edgerR）使用了一個(gè)代償?shù)姆椒?。這個(gè)方法假設(shè)：對于表達(dá)量相似的基因，其誤差方差也應(yīng)該是相似的,。所以在Deseq里面,，會(huì)使用所有基因的方差獲得擬合曲線，來獲得不同表達(dá)量的基因的期望方差（如下圖）,。在重復(fù)數(shù)比較少的情況下,，擬合得到的期望方差理論上會(huì)比單個(gè)基因的估算更準(zhǔn)。

回答完統(tǒng)計(jì)學(xué)角度的問題,，我們再從生物學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的角度來考慮重復(fù)數(shù)設(shè)置的問題,。我們一般會(huì)建議老師測3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，除了統(tǒng)計(jì)角度的考慮,，還有考慮試驗(yàn)的意外因素,。如果測兩個(gè)重復(fù)，而其中一個(gè)樣本發(fā)現(xiàn)有問題而需要被剔除,，就會(huì)導(dǎo)致這組數(shù)據(jù)將非常不可信,。但如果我們有三個(gè)重復(fù)，剔除一個(gè)樣本后,，依然留有兩個(gè)樣本,，保證這組數(shù)據(jù)依然是有重復(fù)的。

我認(rèn)為從統(tǒng)計(jì)的角度,，4個(gè)重復(fù)是理想的,。當(dāng)然，從費(fèi)用的角度來說,，目前依然是太貴了,。隨著測序價(jià)格不斷下降，重復(fù)的設(shè)置應(yīng)該會(huì)慢慢提高的,。