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細胞的原代培養(yǎng),、傳代培養(yǎng),、凍存和復(fù)蘇
導語：細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),。直接從體內(nèi)獲取的組織細胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后,，則需要做再培養(yǎng)
一,、實驗原理
細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從體內(nèi)獲取的組織細胞進行培養(yǎng)為原代培養(yǎng),；當原代培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后,，則需要做再培養(yǎng)， 即將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個或幾個容器中擴大培養(yǎng),，為傳代培養(yǎng),，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細胞的代數(shù)。
細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,，實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力,。目前細胞凍存多采用甘油或DMSO作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高 細胞膜對水的通透性,，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷,。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方 法,，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷,。
二,、實驗方法
材料：
小鼠，生理鹽水,，100ml滅菌燒杯,，15ml離心管，培養(yǎng)皿,，滴管,，無菌鑷子、剪刀,，篩網(wǎng),，泡沫板，大頭針,，酒精燈,，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng) 液,，PBS,，0.25%胰酶，超凈工作臺,、二氧化碳培養(yǎng)箱,、倒置顯微鏡，顯微鏡,，計數(shù)板,，離心機，恒溫水浴箱,，冰箱（4℃、-20℃、-70℃）,，液氮 罐,，凍存管，凍存液,，廢液缸等,。
方法：
（1）原代培養(yǎng)：
1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺內(nèi),，固定在泡沫板上,。
2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開皮膚一個橫切口,，將皮膚向上撕開,，然后剪開肌肉等，暴露出腹腔,，在左側(cè)找到脾臟,，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿中,。
3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次,，并剔除多余無用的組織。
4.將篩網(wǎng)置于平皿中,，脾臟置于篩網(wǎng)上,，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網(wǎng)上進行碾磨,，同時不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗,。
5.將碾磨好的細胞懸液吸入至離心管中，離心(1000rpm,5min),，吸去上清（去除血液等）,。
6.加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻,，取樣計數(shù),。
7.將稀釋好的細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻,，在培養(yǎng)瓶上,。
面做好標志，注明細胞,、組別及日期,。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（2）傳代培養(yǎng)：
1.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),，確定細胞是否需要傳代,。
2.培養(yǎng)液瓶打開后，過酒精燈火焰，置酒精燈火焰周圍,。
3.拿出直頭滴管,，套上橡皮吸頭，過火,，放入培養(yǎng)液瓶中,。
4.打開培養(yǎng)瓶，瓶口過火,，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸,，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。
5.培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶,，用量以薄薄蓋滿一層為宜,，37℃消化，倒置顯微鏡下觀察到細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，使細胞脫離胰酶,，然后將胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基,。
6.取彎頭滴管反復(fù)吹打細胞使其脫壁并分散,，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，制成細胞懸液,，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中,。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn),，以利于CO2氣體的進入,，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。
7.對半貼壁培養(yǎng)細胞,，不需胰酶,，直接吹打，加入新鮮培養(yǎng)基,，然后分裝到各瓶中,。
（3）凍存：
1.吸取傳代后的細胞懸液，離心,，去除培養(yǎng)液,，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內(nèi)細胞數(shù)目一般為（5～10）×106個/ml,，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細胞）,。
2.按步凍存
o冷凍保存方法一：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時,，可增至-5～-10℃/min,；到-100℃時,，則可迅速浸入液氮中。
o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機中每分鐘降1～3℃至-80℃以下,，再放入液氮長期保存,。
（4）復(fù)蘇：
1.取出冷凍管,，立即放入37℃水浴箱中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無菌操作臺內(nèi),。
2.打開凍存管,，將細胞懸液吸到離心管中。
3.1000rpm離心10分鐘,，棄去上清液,。
4.加適當培養(yǎng)液后將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng),，第二天觀察生長情況,。