布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法）使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）的含量,。

l有效期：6個(gè)月

l保存條件：2-8℃

[實(shí)驗(yàn)原理]

試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）捕獲抗原的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*底洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度,。

[樣本處理及要求]

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果）,，稱重后將組*剪碎,。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測,。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。

[需要而未提供的試劑和器材]

1.酶標(biāo)儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

[試劑盒組成]

備注：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：100、50,、25,、12.5、6.25,、3.125 ng/ml

2. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),，可用樣本*釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

[注意事項(xiàng)]

1.嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑。

2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。

4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5.避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果,。

6.在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。

7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體,。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9.不能使用過期產(chǎn)品。

10.如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

[試劑準(zhǔn)備]

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用,。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

[操作步驟]

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；

3. 樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。

4. 除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5. 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

6. 每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

[實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算]

以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并得到直線回歸方程,，將樣品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度,。

[試劑盒性能]

1. 檢測范圍：3.125 ng/ml – 100 ng/ml,。

2. 靈敏度：*低檢測濃度小于0.1 ng/ml。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15% 。

布魯氏桿菌,，一種革蘭氏陰性的不運(yùn)動(dòng)細(xì)菌,，自被發(fā)現(xiàn)以來，便因其強(qiáng)大的生存能力和廣泛的傳播性而受到全球的關(guān)注,。該細(xì)菌無莢膜,，觸酶、氧化酶陽性,，絕對(duì)嗜氧,，可在多種家畜體內(nèi)存活，是引起布魯氏桿菌病的主要病原體,。布魯氏桿菌病，簡稱布病,，是一種人畜共患的慢性傳染性疾病,，嚴(yán)重危害著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。

布魯氏桿菌在土壤,、水中和皮毛上能存活數(shù)周至數(shù)月,，甚至在食品中也能生存約兩個(gè)月。這種頑強(qiáng)的生命力使得布魯氏桿菌能夠在各種環(huán)境中存活,，增加了其傳播的風(fēng)險(xiǎn),。在我國，牛,、羊,、豬是布魯氏桿菌病的主要傳染源，其中羊型布魯氏桿菌對(duì)人體的傳播性*強(qiáng),，致病率最高,，危害最為嚴(yán)重。

布魯氏桿菌的傳播途徑多樣,，主要包括經(jīng)皮膚,、黏膜接觸傳播，直接接觸病畜或其排泄物、陰道分泌物等,，也可通過消化道和呼吸道傳染,。人類主要通過直接接觸病畜或其排泄物，或者食用未加工熟的病畜的肉類及其奶制品而感染,。感染后,，患者可能會(huì)出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱、多汗,、關(guān)節(jié)疼痛,、肝脾腫大等癥狀，甚至可能導(dǎo)致神經(jīng)痛,、體重下降,、厭食等嚴(yán)重不良癥狀。

預(yù)防布魯氏桿菌病的發(fā)生也至關(guān)重要,。預(yù)防措施包括加強(qiáng)家畜飼養(yǎng)管理,，定期接種疫苗，避免接觸病畜和污染的環(huán)境,，以及注意個(gè)人衛(wèi)生,，做到飯前便后洗手，避免交叉感染,。

此外,，隨著全球氣候變暖、生態(tài)環(huán)境變化等問題的加劇,，布魯氏桿菌的生存和傳播環(huán)境可能會(huì)發(fā)生變化,，其傳播風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)進(jìn)一步增加?？偟膩碚f,，布魯氏桿菌是一種危害嚴(yán)重的病原體，其傳播廣泛,，危害大,。我們需要在預(yù)防、治療和研究等方面加強(qiáng)工作,，以保障人類和動(dòng)物的健康,，促進(jìn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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