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競(jìng)爭(zhēng)法ELISA及其操作細(xì)節(jié)
閱讀：4892 發(fā)布時(shí)間：2021-9-8競(jìng)爭(zhēng)法ELISA
“這個(gè)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒總是做不好,，數(shù)據(jù)好奇怪啊" 讓小編帶你走進(jìn)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的小世界，揭秘做好競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)的小技巧和小細(xì)節(jié)。
小概念：
直接競(jìng)爭(zhēng)法：將捕獲抗體固化在微孔板上，加入酶標(biāo)記抗原與待測(cè)樣本,，若待測(cè)樣本中含有抗原，則與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合孔板上的捕獲抗體,。
間接競(jìng)爭(zhēng)法：將捕獲抗原固化在微孔板上,，加入酶標(biāo)記抗體與待測(cè)樣本，若待測(cè)樣本中含有抗原,，則與孔板上的固化捕獲抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)記抗體,。
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)目標(biāo)：
抗體、抗原,、蛋白,、代謝產(chǎn)物
試劑盒的關(guān)鍵：（以直接競(jìng)爭(zhēng)法為例）
捕獲目的蛋白的抗體
使試劑顯色的酶標(biāo)記抗原
ELISA孔板設(shè)計(jì)
ELISA孔板經(jīng)特殊設(shè)計(jì)，可以使各種蛋白及抗體高親和地附著在孔板內(nèi),。
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA是如何實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的,？
（以直接競(jìng)爭(zhēng)法為例）
首先，微孔板預(yù)包被了捕獲抗體,，并用BSA對(duì)微孔板進(jìn)行封閉處理,，這樣做的目的是避免非特異性結(jié)合的產(chǎn)生，降低背景信號(hào),，增加特異性,。
將樣品與試劑盒中的酶標(biāo)抗原充分預(yù)混合后，將混合物加入到微孔板中,。酶標(biāo)抗原與樣品中的目的蛋白可以和捕獲抗體上同一個(gè)表位競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,。（*這一步不同于其他方法）
經(jīng)過(guò)抗原和抗體的充分結(jié)合后,，樣品中的目的蛋白以及試劑盒的部分酶標(biāo)抗原分別與固定在微孔板上的捕獲抗體結(jié)合,，再通過(guò)清洗，洗滌走未結(jié)合的酶標(biāo)抗原和其他非目的蛋白,，最后通過(guò)TMB進(jìn)行顯色,。
當(dāng)樣品目的蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶標(biāo)抗原含量時(shí)，最終結(jié)合在微孔板上的酶結(jié)合物相對(duì)較少,，從而顯色信號(hào)弱（上圖左,。）
當(dāng)樣品目的蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于酶標(biāo)抗原含量時(shí)，最終結(jié)合在微孔板上的酶結(jié)合物相對(duì)較多,，從而顯色信號(hào)強(qiáng)（上圖右,。）
因此檢測(cè)蛋白的含量多少與最終檢測(cè)信號(hào)值的強(qiáng)弱成反比。
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的小細(xì)節(jié)
上個(gè)板塊,，小編帶你們回顧了下競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的基本檢測(cè)原理,，可以看出保證混合物（樣品+酶結(jié)合蛋白）與捕獲蛋白的充分反應(yīng)和結(jié)合是競(jìng)爭(zhēng)法ELISA成功的關(guān)鍵。接下來(lái)，我們講一下實(shí)際操作中影響該環(huán)節(jié)的一些小細(xì)節(jié),。
實(shí)驗(yàn)溫度
實(shí)驗(yàn)溫度會(huì)影響微觀分子運(yùn)動(dòng)的速率以及活化分子比率,。溫度越高，微觀分子運(yùn)動(dòng)增加,，分子碰撞次數(shù)增加,，活化分子比率增加。
同樣對(duì)于酶參與的催化反應(yīng),，過(guò)高或過(guò)低溫度都會(huì)影響酶的活性,，從而影響反應(yīng)效率。
建議：參看產(chǎn)品使用說(shuō)明,，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明推薦溫度操作實(shí)驗(yàn),。
振蕩器的選擇與參數(shù)設(shè)定
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA離不開(kāi)振蕩器的使用。
為什么振蕩器對(duì)實(shí)驗(yàn)如此重要呢,？讓小編帶你走進(jìn)微觀世界的ELISA檢測(cè)（如上圖）,。
從微觀的角度上，固相與液相之間會(huì)形成一層具有邊界效應(yīng)的界面,，稱為邊界層,，這個(gè)層面在一定程度上會(huì)影響抗原與抗體的充分結(jié)合。而振蕩器就能夠起到打破邊界層的阻礙效果,，輔助抗原抗體更加充分結(jié)合,。
通常情況下，大家常常關(guān)注到振蕩器的轉(zhuǎn)速,，也就是500 rpm,，然而另一個(gè)重要細(xì)節(jié)往往會(huì)被忽略——軌道直徑。
軌道直徑 ,，又稱振幅,，也就是托盤(pán)振蕩一圈時(shí)的直徑。根據(jù)天津阿斯?fàn)柹锟萍加邢薰镜膶?shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),，當(dāng)振蕩器振速或振幅不足時(shí),，可能會(huì)造成整體OD值偏低的結(jié)果。當(dāng)振幅過(guò)大時(shí),，可能會(huì)造成微孔板內(nèi)液體飛濺,、樣品孔污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
英國(guó)RSR開(kāi)發(fā)總部使用的是德國(guó)IKA MTS 2/4振蕩器,，如下圖所示。
該產(chǎn)品軌道直徑3mm,，支持1-4個(gè)ELISA板同時(shí)振蕩,，且能夠確保微孔板在振蕩時(shí)既不會(huì)松脫也不會(huì)有液體飛濺,。
經(jīng)過(guò)RSR TJ的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，美國(guó)精騏振蕩器HYQ-3111同樣滿足RSR旗下競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)需求,。（轉(zhuǎn)速200~3000rpm,，振幅4.5mm）。當(dāng)您不確定實(shí)驗(yàn)室的振蕩器是否滿足ELISA實(shí)驗(yàn)規(guī)定時(shí),，可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確保得到穩(wěn)定重現(xiàn)性,。
小小振蕩器，卻藏有這么多不可忽略的小細(xì)節(jié),，進(jìn)而影響到最終實(shí)驗(yàn)的成敗,。因此當(dāng)我們準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，認(rèn)真遵循說(shuō)明書(shū),，如果能對(duì)實(shí)驗(yàn)的基本原理了解透徹,，可以更加保證結(jié)果的準(zhǔn)確。